免疫启动前烟草烟雾暴露促进EAE 发病的细胞免疫机制初步研究

柴嘉擎 王赵伟 吴承龙 蒋琦 王鑫

作者单位：312000 绍兴文理学院医学院（柴嘉擎），绍兴市人民医院神经内科（王赵伟、吴承龙），输血科（蒋琦），风湿免疫科（王鑫）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是最常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病，也是造成青壮年非创伤性残疾的主要原因之一[1]。目前MS 的发病机制还不明确，但普遍认为遗传和环境危险因素共同参与疾病的发生、发展[2]。近年来MS 患病率呈现不断上升趋势，这强烈提示环境因素的影响权重在不断加大。此外，尽管已有多种修饰性治疗药物可减少MS 复发，但仍无法控制病情进展。因此如何预防疾病，寻找根治疾病的手段是现阶段两大研究热点。而明确MS 环境危险因素可为上述研究热点提供新的思路。目前认为MS潜在环境危险因素包括烟草烟雾[3]、维生素D 缺乏[4]、EB 病毒感染[5]、肥胖等。其中烟草烟雾是最为关注的MS 可控性危险因素，但两者是否存在确切因果关系还不明确。因此，有必要进行动物实验研究，探明烟草烟雾是否促进MS 自身免疫反应的激活以及内在的细胞免疫学机制。

笔者团队前期通过MS 动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究发现，幼年期烟草烟雾暴露会加重成年期EAE 症状[6-7]。笔者团队还发现成年大鼠EAE 免疫启动后被动吸入烟草烟雾也会加重EAE 症状[8-9]，提示MS 患病后被动吸入烟草烟雾可促进自身免疫性神经炎症损伤。但烟草烟雾被动吸入是否促进EAE 免疫启动，与CD4+T 亚型分化改变是否有关尚未明确。为明确上述议题，笔者团队设计了本实验，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 清洁级豚鼠（8 只，5 周龄）、成年SD 大鼠（30 只，8 周龄，雌、雄不拘）均购自上海斯莱克实验动物有限公司。豚鼠仅用于取脊髓组织用于后续EAE 造模。30 只SD 大鼠按照体重排序，根据随机数字表法分为烟草组、空气组和空白对照组3 组，每组10 只。本实验严格按照浙江省实验动物管理办法和绍兴市人民医院动物伦理委员会批准的方案实施（批件号：2020-25）。所有大鼠均饲养于SPF 级屏障系统，室内环境温度（22±2）℃，每天14 h 的光照，早上7：00 开灯。

1.2 试剂及仪器 完全弗氏佐剂（批号：F5881）、IL-17F（批号：RAB1906）与IL-10（批号：RAB0246）ELISA试剂盒均购自美国Merck 公司；HE 染色（批号：G1001-100 ML）试剂盒、监牢蓝（luxol fast blue，LFB）髓鞘染色（LFB 染色，批号：G1030-100ML）试剂盒均购自塞维尔生物科技有限公司（中国）；荧光标记叉头蛋白P3（forkhead box protein P3，FOXP3）（批号：NB100-39002PE）抗体试剂盒购自美国Novus Biologicals 公司，CD4(批号：F3100403)购自联科生物有限公司（中国）；FACSCanto 流式细胞仪购自美国BD 公司；酶标仪购自美国Bio-RAD 公司；市售普通卷烟（每支含有尼古丁1 mg，焦油11 mg，一氧化碳11 mg）。

1.3 EAE 模型 豚鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉，再左心室灌注0.9%氯化钠溶液处死，分离新鲜脊髓后，与无菌0.9%氯化钠溶液1∶1 混合后匀浆，4 ℃冷藏备用。脊髓匀浆液与完全弗氏佐剂等体积混合，采用注射器反复抽打的方法制作成“油包水”乳剂。SD大鼠经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后用上述乳剂进行皮下注射，剂量为0.4 ml/只。EAE 模型制作的当天计为造模后第0 天。

1.4 被动吸烟模型制作 参考本实验室前期方法[6]，将市售普通卷烟产生的侧流烟雾先在调控烟腔滞留2 min，再与过滤的压缩空气混合，混合后的烟草烟雾导流到暴露烟腔。烟草组大鼠在暴露烟腔内滞留1 h/次，2 次/d。被动吸烟期间烟草烟雾的尼古丁浓度、悬浮颗粒和一氧化碳平均浓度为（112±28）μg/m3、（1.24±0.17）mg/m3、（6.70±0.41）ppm。空气组与空白对照组留置于过滤压缩空气中。

1.5 实验干预 烟草组在EAE 造模前1 周连续被动吸入烟草烟雾7 d 后进行EAE 造模；空气组在EAE 造模前连续吸入过滤压缩空气7 d 后进行EAE 造模：空白对照组在EAE 假造模（用0.9%氯化钠溶液代替豚鼠脊髓匀浆液处理大鼠）前连续吸入过滤压缩空气7 d 后进行EAE 假造模处理。EAE 造模后每日观察大鼠行为学变化，并在造模后第1～20 天按照EAE行为学评分标准进行评分，其中0 分为无明显活动异常，1 分为尾部出现无力症状，2 分为轻微后肢无力症状，3 分为严重的后肢麻痹，4 分为四肢麻痹，5 分为濒死或死亡。

1.6 病理学检测 EAE 造模后第21 天，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后，左心室灌注0.9%氯化钠溶液处死，分离脊髓组织并于40 g/L 多聚甲醛溶液中固定24 h，经乙醇梯度脱水、石蜡包埋等处理后切片（厚度5 μm）。HE 染色：石蜡切片经二甲苯脱蜡等处理后，按照试剂盒说明书提供的方法，进行苏木素与伊红染色、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶固封等处理。在光学显微镜下观察颈髓、胸髓、腰髓切片炎症反应。按照如下标准进行HE 染色病理评分：0 分为无炎症改变，1分为炎性细胞浸润局限于血管周围和脑膜，2 分为脊髓实质轻度炎性细胞浸润（1～10 个细胞/切片），3分为脊髓实质中度炎性细胞浸润（＞10～100个细胞/切片），4 分为脊髓实质重度炎性细胞浸润（＞100 个细胞/切片）。LFB 染色：石蜡切片脱蜡至水、切片进入预热的髓鞘染液A 中65 ℃染色4 h、水洗、髓鞘染液B 快速分化5 s、髓鞘染液C 中快速分化10 s，交替浸入髓鞘染液B 和髓鞘染液C 中进行分化，镜检直至髓鞘呈蓝色背景近无色，然后水洗终止分化。切片经3 次无水乙醇脱水，5 min/次，再经二甲苯透明5 min，然后用中性树胶封片。采用Image J 软件分析脊髓白质区脱髓鞘百分比。

1.7 流式细胞检测 分离脾脏细胞后用尼龙网过滤去除细胞团块，按照试剂盒说明书提供的方法，加入荧光标记CD4 抗体、FOXP3 抗体。已知CD4 与FOXP3阳性表达的调节性T 细胞（regulatory cells,Treg）是EAE的免疫抑制性淋巴细胞。通过流式细胞仪进行检测，采用FlowjoV 10.6.2 软件分析CD4 与FOXP3 阳性淋巴细胞百分比。

1.8 细胞因子IL-17F、IL-10 水平检测 采用ELISA法。大鼠麻醉后用注射器从脑池中提取脑脊液。脑脊液样品在液氮中快速冷冻，并在-80 ℃环境下保存。按照试剂盒说明书提供的方法检测IL-17F、IL-10 水平，最后使用上述酶标仪测量光密度。

1.9 统计学处理 采用GraphPad Prism 8 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料组间比较采用Fisher 确切概率法。日均行为学评分比较采用两因素重复测量的方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烟草烟雾暴露对EAE 行为学评分的影响 空白组大鼠在观察期内均未出现神经功能损害的表现，行为学评分均为0，因此，后续行为学评分比较仅纳入烟草组与空气组数据。其中烟草组EAE观察期内最高行为学评分高于空气组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但两组发病潜伏期和发病率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。进一步对每日行为学评分比较发现，EAE 造模后的第12、13 天评分均高于空气组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表1 烟草烟雾暴露对EAE发病潜伏期及最高行为学评分的影响

表2 烟草烟雾暴露对EAE日均行为学评分的影响（分）

2.2 烟草烟雾暴露对EAE 脊髓炎症与脱髓鞘的影响 HE 染色显示，空气组脊髓组织切片可见播散性分布的单个核细胞，部分区域可见炎症细胞聚集；烟草组脊髓组织切片可见大量的炎症细胞聚集，严重的区域可以观察到围绕小血管分布的炎症细胞聚集，形成“淋巴袖套”；空白对照组未见髓鞘脱失与炎症细胞聚集，见图1（插页）。烟草组颈髓、胸髓、腰髓HE 染色病理评分和脱髓鞘百分比均高于空气组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

图1 烟草烟雾暴露对EAE 脊髓炎症与脱髓鞘的影响

表3 烟草烟雾暴露对EAE脊髓炎症与脱髓鞘损伤的影响

2.3 烟草烟雾暴露对CD4+T 细胞分化的影响 烟草组抗炎的CD4+FOXP3+T 细胞百分比低于空气组，而具有致病性的CD4+FOXP3-T 细胞百分比高于空气组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 烟草烟雾暴露对CD4+T细胞分化的影响（%）

2.4 烟草烟雾暴露对脑脊液细胞因子的影响 烟草组脑脊液IL-17F 水平高于空气组，IL-10 水平低于空气组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

表5 烟草烟雾暴露对脑脊液细胞因子的影响（pg/ml）

3 讨论

MS 是一种神经系统自身免疫性疾病，目前无法预防疾病和控制病情进展。近年来，全球MS 患病率有不断扩大趋势[10]，可能和社会环境、生活方式的改变有关联，已引起广泛关注。Lorefice 等[11]观察性研究关注到烟草烟雾暴露与MS 发病风险增加有关。但也有矛盾的研究结果，Koch 等[12]研究认为吸烟与MS 疾病残疾症状恶化、认知功能减退无关。由于观察性研究容易受到回顾性偏倚、选择性偏倚等混杂因素干扰，因此不能简单地将相关性认同为因果性[13]。孟德尔随机化研究是一种可以推断相关性是否存在因果性的流行病学研究方法。但孟德尔随机化研究对于烟草烟雾暴露和MS 发病的因果关系，结论也存在矛盾[14]。总的来说烟草烟雾与MS 风险增加、疾病恶化是否存在因果关系还不明确。

本研究在EAE 诱导前给予烟草烟雾暴露，模拟真实环境条件下烟草烟雾短期暴露对MS 发病的影响，以明确烟草烟雾是否促进EAE 免疫启动。结果显示，与空气组比较，烟草组EAE 急性期神经功能受损症状更为严重。由于EAE 发病导致运动功能受损，会干扰记忆、焦虑、抑郁等动物行为学检测结果，无法准确、全面评估脑高级功能方面的影响，是本研究存在的客观局限性。但后续病理学检查覆盖了各脊髓节段，分析了炎症和脱髓鞘情况，可以发现亚临床病变一定程度上弥补了行为学观察造成的偏倚。本研究发现，烟草组脊髓组织中有更多的炎症细胞聚集，脱髓鞘也更严重，可见烟草烟雾促进了EAE 脊髓自身免疫攻击，加重了疾病症状和脊髓病理损伤。

细胞免疫参与介导MS 中枢炎症反应，其中CD4+T细胞是关键的免疫细胞，可分为不同亚型，包括Th1、Th2、Th17 和Treg。Th17 细胞可分泌IL-17A、IL-17F、IL-22 等促炎症因子，促进神经炎症[15]。MS 患者脑脊液中Th17 细胞数量明显增加，被认为是MS/EAE 的致病细胞[16]。Treg 细胞可以分泌IL-4、IL-10、转化生长因子-β 等抗炎细胞因子，被认为是MS/EAE 的抑炎细胞[17]。最近一项研究发现烟草烟雾可通过肺-免疫-脑轴调控中枢神经免疫反应[18]。还有研究发现烟草烟雾通过影响适应性免疫反应，改变Th17/Treg 细胞的动态平衡[19]。本研究通过流式细胞术分析EAE 大鼠脾脏来源的CD4+T 细胞亚群，发现烟草组抑制CD4 与FOXP3双阳性的Treg 细胞分化，促进自身免疫反应的CD4+FOXP3-T 细胞分化。进一步通过ELISA 法检测脑脊液发现，烟草组脑脊液致炎性IL-17F 水平升高，而IL-10水平下降。因此，烟草烟雾对EAE 免疫启动阶段的影响可能与Treg/Th17 细胞亚群失调有关。

综上所述，发病前被动吸入烟草烟雾造成了EAE运动功能损害症状加重、中枢炎症反应和脱髓鞘损害加剧。烟草烟雾可能通过抑制Treg 细胞分化，促进促炎因子IL-17A 释放，减少抗炎因子IL-10 释放，造成EAE 病情恶化。这与以往吸烟和暴露于烟草烟雾环境中会使MS 的患病风险增加的研究结果[20-21]具有一致性，但考虑到观察性研究和动物实验都存在一定局限性，有必要进行大样本临床研究，并结合动物实验深入机制探讨。