乳酸菌胞外多糖的研究进展

赵婧，高永娇，孙靖辰，左锋，潘禹溪，邰孟蝶，王坤

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是目前各研究领域公认使用的一种益生菌。它主要利用碳水化合物来发酵，在人体生命活动和脂肪代谢分解过程中产生少量乳酸。乳酸菌在自然界中分布极其广泛，且种类繁多。目前发现的乳酸菌共有约23 科属，200多个种，菌株更是不计其数[1]。大量研究表明，乳酸菌作为主要的益生菌之一，在调节肠道菌群、促进人体生长发育、预防和控制疾病等方面发挥着非常重要的作用。

胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是一类由一些微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的次级代谢产物，一般由重复的糖单元或多糖衍生物、不同结构比例的单糖、葡萄糖、半乳糖和鼠李糖组成[2]。根据与菌体细胞的依附关系，可将EPS 分为荚膜多糖和粘液多糖。其中，附着于菌体细胞壁且与之紧密结合的称为荚膜多糖；而被释放到菌体外部的环境介质中的则称为粘液多糖[3]。由于乳酸菌EPS 独特的理化性质，在食品工业中常被广泛用作稳定剂、乳化剂、微生物蛋白絮凝剂、生物吸附剂和新型离子交换树脂等[4]。同时，由于EPS 的分子量组成方面差异较大，对增强机体有益生元可起协同作用，如促进人体自身免疫调节反应、抗肿瘤、抗氧化、调节宿主肠道微生态平衡等功能。将主要对乳酸菌EPS 的分类、组成、分离纯化、结构鉴定和生理活性等方面进行阐述，旨在为今后的EPS 研究提供理论参考。

1 乳酸菌EPS 的种类及其结构

目前，已经发现很多种可以产胞外多糖的乳酸菌，包括乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属和乳球菌属等，其中研究最多的为链球菌属内的嗜热链球菌[5-6]。

乳酸菌产生的EPS 可按其单糖组成分为同型多糖（Hops，homopolysaccharides）和杂多糖（Heps，heteropolysaccharide）。同型多糖结构简单，分子量小，按结构不同可分为：α-D-葡聚糖、β-D-半葡聚糖、β-D-果聚糖、聚半乳糖和其他聚糖等[7]。杂多糖结构复杂且分子量大，由两种或两种以上的单糖单元聚合而成。其中D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖都是最常见到的单糖单元[8]，有些多糖中还含有一些其他单糖单元，如：L-岩藻糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸，或者一些非糖组分，如：甘油、磷酸盐、D-壬酸、丙酰基和乙酰基等[9]。

2 乳酸菌胞外多糖的分离纯化及结构鉴定

乳酸菌粗EPS 成分相对复杂。首先，需要经过一系列分离纯化过程才能提取得到单一组分，分离纯化有许多种方法，一般常用分离方法为水提醇沉法，纯化方法为凝胶色谱法；其次，通过对纯化后的多糖样品进行结构鉴定和理化性质分析，并确定其单糖组成情况和空间结构，同时还需要分析修饰的单糖结构；最后分析其修饰后的多糖的微观结构变化和生理活性。因此，若要准确的研究乳酸菌EPS 的结构组成、生理活性及构效关系，很有必要对乳酸菌粗EPS 进行分离纯化，并采取合适的方法提高其得率。

2.1 分离纯化

分离纯化是结构鉴定的基础，所以这一过程至关重要。通常乳酸菌EPS 的分离纯化技术包括以下几步：EPS 的分离、纯化与纯度鉴定。分离的具体过程一般包括除菌体、除蛋白、脱色素和多糖沉淀等，大多数采用的都是水提醇沉法。除蛋白常用三氟三氯乙烷法、TCA 法、酶解法和Sevag 法等[10]。在提取过程中，氧化作用会导致EPS 产生色素，如果颜色较浅则采用过滤的方法去除即可；若颜色较深则采用浓氨水和氢氧化钠调节pH 为8.0，并在50 ℃加入双氧水至浅黄色，恒温2 h 便可去除[11]。沉淀EPS 通常采用乙醇、异丙醇或丙酮等有机溶剂进行。其中异丙醇和乙醇的沉淀效果最佳，但由于异丙醇在安全性方面还存在很多争议，所以通常采用无水乙醇作为有机沉淀剂[12]。

沉淀后的粗多糖还需进一步的纯化，才可以得到单一的纯组分。多糖的纯化方法通常有透析法、离子交换柱层析法和凝胶柱层析法等。透析法通常是根据样品分子大小不同，小分子物质经过透析后即被分离出体系，而大分子的EPS 则被保留下来。凝胶柱层析法也是根据样品分子量的差异进行提纯。王静颖等[13]采用DEAE-纤维素柱层析法对发酵牛乳中提取的乳酸菌EPS 进行纯化，结果表明纯化效果比较好。由此可见，柱层析法对EPS 的纯化起着非常重要的作用，且分离效果比较理想。

2.2 结构鉴定

由于多糖的结构往往比较复杂，且其单糖组成差异相对较大，而结构是功能的基础，因此对乳酸菌EPS 的结构分析和判断其分子空间构象关系是必不可少的。首先，可以通过检测糖链分子量、单糖组成、摩尔比和单糖残基的三维空间构型、排列顺序和连接方式等基本信息来分析判断一级结构。目前，多糖一级结构鉴定常用的方法有紫外吸收光谱法、红外光谱法、核磁共振波谱法、高效液相色谱法、甲基化分析等[14]。红外光谱法常采用KBr 压片法结合傅里叶红外光谱图的变换，对EPS 光谱图的特征吸收峰进行解析处理；气相/液相色谱主要是对EPS 的单糖摩尔比进行定性定量分析；核磁共振是结合甲基化分析结果，来确定糖苷键的构型和连接方式。Wang 等[15]对植物乳杆菌YW32 的EPS 进行分离纯化和结构鉴定，确定其分子量大约为1.03×105Da，是由摩尔比为8.2∶1∶4.1∶4.2 的甘露糖、果糖、半乳糖和葡萄糖组成。Zhou 等[16]对植物乳杆菌BC-25 的EPS 进行分离纯化，结果表明其分子量为1.83×104Da，由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，摩尔比为92.21∶1.79∶6.00，其结构为（1→2）连接的甘露糖，（1→2，6）连接的葡萄糖，（2→6）连接的甘露糖和（2→6）连接的半乳糖。

对乳酸菌EPS 高级结构的鉴定常采用的方法包括二维核磁共振（2D-NMR）、X 射线衍射（XRD）、原子力显微镜（AFM）、刚果红实验、圆二色谱（CD）、差示扫描量热法（DSC）等。在EPS 结构鉴定中，通常将核磁共振、红外光谱、高效液相色谱和甲基化等方法联合使用。邵丽[17]采用原子力显微镜观察了不同浓度鼠李糖乳杆菌KF5 的EPS 在水溶液中的形貌变化，结果表明随着EPS 浓度的减小，EPS 的聚集性明显减小，表观形貌发生从膜状、岛屿状、网状到单链/双链结构的变化。采用SDS 消除分子间氢键作用，观察到延展的多糖分子链和环形的侧链，说明分子具有分支结构。Li 等[18]采用刚果红实验对螺旋乳杆菌MB2-1 的c-EPS 进行结构鉴定，结果显示c-EPS 样品与刚果红染料反应后最大吸收波长发生红移，表明Lactobacillus helveticus MB2-1 的c-EPS 具有三股螺旋构象。用原子力显微镜对c-EPS 进行分析，发现c-EPS 具有许多不同大小的像纤维状的多糖分子链。

3 乳酸菌EPS 的生理活性

乳酸菌作为对机体健康有利的活性微生物，其产生的多糖化合物大都具有抗氧化、抗肿瘤、改善人体肠道微生态、抗生物膜、吸附可溶性重金属等生理活性，且这些益生特性既可以开发为天然食品添加剂应用于现代食品工业中，还可以应用于医疗行业辅助癌症治疗等，并具有安全性高、抗癌效果良好、副作用小等优点。

3.1 抗氧化活性

乳酸菌EPS 的抗氧化活性取决于胞外多糖的结构、分子量、糖残基组成、糖苷键的构型和组成比例等[19]。Streptococcus phocae PI80 的EPS 在体外实验中表现出优异的抗氧化活性，尤其是对羟基、超氧化物自由基等具有极强的清除活性作用[20]。Zhang 等[21]研究发现，植物乳杆菌C88 的EPS 在体外能够快速有效地清除过量产生的生物活性氧（ROS），且该多糖也具有清除超氧自由基、提高细胞体外抗氧化和酶活性等作用。Wang 等[15]通过测定植物乳杆菌YW32 体外抗氧化活性，发现植物乳杆菌YW32 的EPS 对DPPH、羟基以及超氧自由基都显示出较强的清除作用。

3.2 抗肿瘤活性

国内外多项研究已表明，乳酸菌EPS 具有天然抗肿瘤活性，其生物学作用机理主要有以下3 种：（1）诱导免疫反应；（2）抑制肿瘤细胞增殖；（3）诱导细胞凋亡[22]。乳酸菌EPS 在结肠癌等癌症的预防和控制方面均有应用，其能够通过调节肠道黏膜和全身免疫反应以及减少对宿主微生物群的炎症反应来抑制疾病[23]。研究表明，乳酸菌EPS 不仅可以通过促进免疫系统来增强机体抗肿瘤作用，还可以通过靶向杀伤作用促进肿瘤因子凋亡。Galdeano 等[24]分析了乳酸菌EPS 诱导的细胞免疫反应，测试了乳酸菌EPS 对肿瘤因子的影响，发现乳酸菌EPS 能显著的抑制TNF-α、白介素-1β（IL-β）和转化生长因子-β的增加，从而表现出抗肿瘤作用。Lee 等[25]研究表明，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和长乳杆菌分泌的EPS 可以抑制肿瘤细胞增殖，并具有免疫调节作用。Chen 等[26]分析了嗜酸乳杆菌的EPS 对小鼠结直肠癌的影响，发现嗜酸乳杆菌的EPS 可有效降低结直肠癌细胞发生几率，并促进结肠癌的细胞凋亡。Wang 等[15]对植物乳杆菌YW32 EPS 的抗肿瘤活性进行了研究，结果表明在处理72 h 后，600 μg·mL-1剂量的EPS 对人体结肠癌HT-29 细胞表现出明显的抑制作用，且抑制率最高可以达到39.24%，同时推测其对肿瘤的抑制活性与其羟基及超氧自由基的清除活性有关。综上所述，乳酸菌EPS 作为一种天然的高分子化合物，可作为抗肿瘤药物应用到医药领域中。

3.3 肠道菌群的调节作用

乳酸菌EPS 能够有选择性的促进体内有益菌生长和增殖，抑制有害菌的增殖和有害物质的产生。研究表明L.rhamnosus KF5 EPS 可以有效促进人类肠道黏膜内双歧杆菌的生长，还可以显著提高人体肠道菌群的微生物多样性[27]。Wang 等[15]的研究表明，5.0 mg·mL-1乳杆菌YW32 EPS 可以对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌4种病原菌的生物膜形成较强的抑制作用，从而达到调节肠道菌群平衡的作用。EPS 还能通过增强细菌生物膜的抗生素敏感性，减弱致病菌微生物的细菌耐药性，从而达到间接抑菌目的。

乳酸菌EPS 能有效促进多种肠道益生菌在宿主肠壁上的黏附，在非特异性黏附和特异性黏附过程中均发挥着重要作用。益生菌黏附于肠粘膜上皮细胞后，可进一步通过提高自身代谢产生游离脂肪酸，使肠道处于酸性环境条件中，保持自身定殖的优势，有效阻止潜在肠道致病菌微生物及其毒素在肠粘膜上皮细胞的黏附繁殖和侵入，从而长期维持人体肠道微环境酸度的平衡[28]。

3.4 免疫活性

研究表明，乳酸菌EPS 能够调节机体免疫[29]。乳酸菌EPS 通过激活机体免疫细胞、促进单核细胞的吞噬能力、调控免疫细胞因子的分泌来调节机体的免疫功能。Hidalgo-Cantabrana 等[30]证实乳酸菌EPS能够有效激活从大鼠血液中的T 淋巴细胞和分泌细胞因子来提高免疫活性。You 等[31]研究了戊糖乳杆菌LZ-R-17 的EPS 对RAW264.7 细胞吞噬活性的影响，结果表明LZ-R-17 的EPS 在浓度为50~400 μg·mL-1时，显著增强了RAW264.7 细胞的吞噬能力，且呈剂量依赖性（P<0.05）。在最高处理浓度为400 μg·mL-1时，吞噬指数为1.42，显著高于对照组（P<0.05），说明LZ-R-17 的EPS 能有效诱导RAW264.7 巨噬细胞的免疫应答。此外，Fanning 等[32]表明，双歧杆菌的EPS可以降低促炎因子在宿主体内的定植，进而达到促进机体免疫的效果。

乳酸菌EPS 诱导的另一种免疫调节特性是通过促进宿主免疫球蛋白A（IgA）的分泌来刺激黏膜免疫系统，加强第一道防线，如黏膜屏障[1]。IgA 是上皮细胞黏液中最丰富的同型免疫球蛋白，可以捕获抗原，从而阻止它们与细胞表面受体结合。Matsuzaki 等[33]研究证实，肠系膜乳杆菌菌株NTM048 可作为一种益生菌增强肠道黏膜的屏障功能，而从肠系膜乳杆菌菌株NTM048 中提取的EPS 在体内体外均具有诱导IgA 增殖的能力，其表现在菌株NTM048 的EPS可以刺激淋巴细胞产生IgA，避免机体遭到病原体的入侵，从而达到机体免疫调控作用。综上所述，乳酸菌的EPS 对机体具有免疫调节作用。

3.5 抗生物膜活性

生物膜被定义为于物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体，以响应各种环境信号，如外源性应激，并使它们能够逃离宿主的免疫系统[34]。Lynch 等[35]推测EPS 可以直接粘附于肠道黏液上，然后通过阻止有害物质的粘附，从而竞争性地抑制其他有害细菌的粘附。

Mahdhi 等[36]研究了植物乳杆菌EPS 对致病菌的抑制作用，结果表明4 株致病菌株中有2 株的抑制率超过50%。同时，检测了EPS 对生物膜的清除试验，结果表明清除率均超过50%，且随着EPS 浓度的增加，其生物膜的清除能力有所提高。Sarikaya 等[37]证明发酵乳杆菌LB-69 产生的EPS 可以抑制医疗设备上生物膜的形成。Kim 等[38]研究，表明含有1.0 mg·mL-1嗜酸乳杆菌r-EPS 对聚苯乙烯和聚氯乙烯96 孔塑料微板表面的肠出血性大肠杆菌（EHEC）—生物膜均有显著的抑制作用，抑制率分别高达87%和94%。

4 乳酸菌EPS 在食品工业中的应用

在食品工业中，乳酸菌通过发酵产生EPS，而EPS在食品感官特性中发挥着重要作用。乳酸菌EPS 可作为凝胶剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂、水结合剂和粘化剂应用到食品工业中。此外，乳酸菌EPS 在发酵乳制品和谷物类产品的制备中也具有潜在的作用。乳酸菌EPS 具有益生元特性，还可以调节肠道菌群、增强机体免疫活性等功能。因此，在食品中添加乳酸菌EPS 可以生产出更多提高人类健康的功能性食品。

4.1 在发酵乳制品中的应用

流变性、粘稠性及乳化性是评价乳制品品质高低的重要的指标。乳酸菌EPS 可以直接赋予乳制品一种独特感官性质和口味，其还可以提高酸奶粘度、减少乳清析出和颗粒感，对保证产品外观的均一性起着非常重要的作用[39]。Li 等[40]将植物乳杆菌70810及其他两种工业发酵菌种分别用于豆乳的发酵中，发现产EPS 的70810 菌株能更好地提高发酵豆乳的粘度及其他感官特性。Mende 等[41]将纯化的嗜热链球菌ST-143 EPS 加入到发酵牛乳中，发现发酵牛乳凝胶度和粘稠度会随加入EPS 浓度的增大而逐渐增大。乳酸菌EPS 能够在普通发酵豆乳原料的生产中起到一定作用，也因其本身具有的高保水性、高粘度性，使其可以很好地保持豆奶产品原本具有的独特风味。因此，乳酸菌EPS 能够很好的改善发酵乳制品粘稠性与凝胶性等特殊的理化产品特性，使发酵乳口感更加细腻饱满，能满足更多消费者对口味的追求。

4.2 在焙烤食品中的应用

烘焙食品作为人们最受欢迎的休闲食品之一，其外观和味道会直接影响其销售量。乳酸菌EPS 对焙烤食品的颜色、微观结构、保水性、流变性和保质期有一定的影响。乳酸菌EPS 可以用来替代传统面团中的面筋凝胶（麸质），发挥其独特的凝胶作用，改善面包纹理结构，延长产品的保质期[42]。Lynch K 等[43]将一种产多糖的植物乳杆菌CC2 和商业发酵剂用于切达干酪（焙烤食品中常用的奶制品之一）的生产。结果表明，与使用普通的商业发酵剂相比，产多糖发酵剂生产干酪具有更好的保水性，且乳酸菌EPS 对蛋白质水解完全没有负面影响。因此，乳酸菌EPS 能够直接赋予烘焙食品更好的品质和口感，在烘焙食品中具有良好的开发和应用前景。

4.3 在果酒中的应用

乳酸菌EPS 具有一定的流变性能，可作为乳化剂、稳定剂和絮凝剂广泛地应用到国内外各种功能性食品领域中，在果酒行业也有着较为良好的应用前景。李建军等[44]首次提出将植物乳杆菌FM-L1-3 EPS 和肠膜明串珠菌T-L1 EPS 作为食品添加剂直接应用到黑莓果酒酿造加工中，并对其参数含量进行测定。结果表明，适量添加乳酸菌EPS 处理后的黑莓果酒，能明显降低导致果酒沉淀的游离蛋白及总酚含量，并提高黑莓果酒的澄清度和酒的热稳定性，同时延长贮其储藏期，当胞外多糖添加量为500 mg·L-1时，FM-L1-3 EPS 处理的果酒中总酚含量降低了24.34%，蛋白质含量降低了35.82%；T-L1 EPS 处理的果酒中总酚含量降低了32.71%，蛋白质含量降低了46.06%。另外，把乳酸菌EPS 加入到黑莓果酒生产可以有效减少黑莓果酒在发酵过程产生的不良影响，提高黑莓果酒的品质。

4.4 在干酪制品中的应用

由于高脂干酪对消费者健康的负面影响，消费者高度需要低脂干酪。然而，饱和脂肪含量的降低会导致干酪本身的一些物理性质受到严重影响，尤其是水分的减少会导致其质感和弹性产生劣变。EPS 能在一定的程度上有效改善低脂干酪质地和味道，而不需要添加额外的添加剂。乳酸菌属的许多菌株（保加利亚乳杆菌、螺旋乳杆菌和干酪乳杆菌）产生的EPS 对干酪的流变学特性有显著影响。朱莹丹等[45]研究了乳酸菌EPS 在干酪加工中的作用，发现加入乳酸菌EPS 参与干酪的发酵可以适当的提高发酵干酪制品的粘稠度、稳定性和及水合能力，并且还能在一定程度上促进干酪的成熟，增加干酪的营养和风味物质产生。乳酸菌EPS 中同型多糖的一些侧链结构是改善干酪制品质地的主要原因，如N-乙酰化糖基可以提高与乳蛋白结合的能力；EPS 通过与环境中的结合水、蛋白质沉淀和胶体颗粒之间的相互作用，有效的抑制了乳制品因自然脱水而导致的收缩，减少了乳清蛋白质的沉淀，提高了奶酪块的延展性和保水性。

5 结论与展望

近年来，对微生物EPS 的研究已成为一个重要的研究领域。关于其结构的研究已经成为热点，而研究手段和技术也不断得到提升。乳酸菌可以产生多种不同化学组成和结构的EPS，从而可以广泛的应用到功能性食品的开发中，为食品工业的发展提供良好的原料和前景。作为一种纯天然、无毒无害性的高分子化合物乳酸菌EPS，不仅能作为添加剂用于食品生产，还可以对机体进行免疫调节、清除自由基、抗病毒、抗生物膜、降压、降胆固醇和抑制癌细胞生长。乳酸菌EPS 在未来生物合成制药、食品工业开发和相关临床医学应用中均有广泛的应用前景，对促进人类营养健康和确保食品安全具有重要的社会意义。因此，继续对乳酸菌EPS 进行一些更精准、更细致、更深入的研究十分有必要，使乳酸菌EPS 的应用更具有广泛性。