PDGF促进创面修复的研究进展

赵 琴，张进进，陈立力，邢颜超

1新疆医科大学研究生院，乌鲁木齐 830054 2新疆军区总医院输血医学科，乌鲁木齐 830000

创面愈合是一个由多种细胞、细胞因子及组织有序参与的动态过程，修复过程的复杂性及影响因素的多样性导致清创引流、皮瓣移植及功能性敷料等多种传统治疗方法无法达到理想的愈合状态[1]，故寻求一种高效、安全、经济的创面愈合策略已成为研究的热点[2]。研究发现血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)具有促进细胞增殖、分泌及迁移的作用，可直接参与创面修复过程，是创面修复领域极具应用前景的活性因子[1]。目前，以PDGF为活性成分，已衍生了多种极具应用潜力的创面修复策略。本文就PDGF的生理特性与应用特性及其在创面修复中的研究进展作一综述，以期为临床创面修复提供借鉴。

1 PDGF概述

1.1 PDGF生理特性

PDGF是间充质来源细胞的有丝分裂原，生理条件下储存于血小板α颗粒内[3]，组织损伤后由血小板崩解释放并活化[4]。PDGF包含PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D 4种亚型，单体结构可通过二硫键形成PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-AB同型或异型二聚体，与受体PDGFRα或PDGFRβ相结合后可促进受体发生二聚化或寡聚化[5]，使得多个位点磷酸化，并与含SH2结构域的信号蛋白相互作用，继而激活Ras-MAPK、PI3K或PLC-γ等信号级联通路[6]，启动细胞生长、增殖、分泌、迁移及表型转化等多种效应过程[7]。此外，作为化学引诱剂，PDGF可刺激成纤维细胞、平滑肌细胞、中性粒细胞趋化至损伤部位以发挥局部抗炎、分泌、再上皮化等作用，并释放多种细胞因子，产生细胞因子“鸡尾酒”[4]，亦可通过招募血管平滑肌细胞和周细胞重建局部血管系统[8]。在PDGF家族成员中，PDGF-BB与受体的亲和力较强，可触发不同的信号通路，是唯一可与PDGFRαα、PDGFRββ及PDGFRαβ 3种表面受体相结合的二聚体[9-10]，组织修复效应最佳[11]。

PDGF可通过血小板或体外合成获得。其中血小板是PDGF的天然来源[4]，基于血液提取获得的血小板制品是PDGF的重要原料[3]。20世纪末，血小板制品开始应用于组织修复领域，根据制备方法的不同可分为血小板浓缩提取物(platelet concentrates，PC)和血小板裂解液(platelet lysate，PL)两类，其修复能力已得到认可[12]。将PDGF基因转入酵母等微生物遗传信息中构建工程菌株，可实现体外合成、工业化生产PDGF，因其不受血液来源的限制而备受青睐。此外，还可通过向创面递送PDGF基因，转染创面细胞，促进局部表达、合成PDGF，而利用血小板、重组人PDGF或PDGF基因提高创面中局部PDGF浓度，可实现创面的高效愈合。

1.2 PDGF应用特性

PDGF临床应用需以安全性、有效性为前提。PDGF可与不同靶点相结合继而产生多种效应，如游离入血的PDGF循环至其他部位产生的脱靶效应，可促进癌症进展，故为保证安全性，应尽可能减少脱靶效应的发生。缩小PDGF活性谱并放大特定靶标活性可直接减少脱靶效应[13]，但技术上难以实现。降低PDGF循环浓度是减少脱靶效应的可行途径，如局部外用可避免PDGF直接入血导致的超高循环浓度带来的风险，但经皮肤吸收入血的PDGF产生的脱靶效应亦不容小觑，因而局部外用的安全性难以保证。降低PDGF应用剂量可有效减少循环中的PDGF浓度，这似乎阻碍了修复进程，但研究发现远超生理浓度的重组人PDGF仍需大量、反复使用以获得最佳疗效，提示应用浓度与有效浓度存在较大差异，存在较大部分的PDGF无效甚至有害，故促使PDGF有效浓度无限趋近于应用浓度，是保障PDGF创面修复安全、高效的关键。增加PDGF局部驻留率，可在减少循环PDGF浓度的同时提高其局部有效浓度并延长作用时间，是安全高效的可行之策，而动力强劲的递送系统可显著提升PDGF局部驻留率，并可通过时空控释模拟生长因子的生理释放顺序，是解决多因子共同应用时副作用增多的有效策略。提高PDGF生物活性可增强其信号传导强度，提高创面修复能力。PDGF生物活性受其功能结构域及N-端、C-端多肽序列的调控，可对其内部结构进行改造以设计生物活性更高的PDGF。随着基因工程技术的发展，PDGF基因递送策略成为PDGF创面修复的热点，通过基因转染创面细胞可原位合成PDGF，其具有更精准的生物活性结构和更少的不良反应，为创面修复提供了更佳选择。

2 PDGF创面应用研究

研究者基于PDGF的生理及应用特性，在PDGF创面应用方面开展了大量研究，继而大力推动了创面修复问题的顺利解决，而PDGF安全高效的创面应用策略还可推广至其他类型组织修复及细胞因子的临床应用中，对整个组织再生领域均有极其重大的临床意义。

2.1 PDGF与PC

PC主要包括富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)及优化改进后获得的富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)和浓缩生长因子(concentrated growth factor，CGF)。1984年，Assoian等人通过向全血标本中加入抗凝因子[14]并根据成分密度的不同进行梯度离心，成功分离、获得了PRP，其组织修复性能突出，在骨科、整形科等多学科广泛应用。PRP激活后可快速释放大量包括PDGF在内的多种生长因子，并产生短暂的释放高峰，但因缺乏缓释结构，且因生长因子半衰期短，加上多种生物制剂对修复的负面影响[15]，以致PRP对创面修复的实际效果与预期效能不符。此外，PRP储存条件较为严苛，且随着保存时间延长，血小板逐渐失去活性和功能，生长因子浓度逐渐下降，故PRP的有效期仅为5 d[16]。2000年，Choukroun将不添加任何血小板活化物质，仅通过一步离心制备而成的二代PC定义为PRF，其富含纤维蛋白，而纤维蛋白天然聚合形成的网状支架结构可捕获PDGF并维持其缓慢释放，在延缓PDGF降解的同时可延长其作用时间；此外，根据临床需求，PRP可制成特殊的剂型，如因该制品结构致密，可以膜状覆于创面，亦可进一步优化为可注射的PRF[17-18]，在复杂颌面部创面修复中优势显著；同时，为避免玻璃采血管内的二氧化硅颗粒对患者产生健康损害，采用钛管制备获得了钛制备的血小板纤维蛋白[19]。但由于PRF未添加抗凝剂，血液采集后需立即制备使用。2006年，由Sacco进一步改进PC得到了CGF[20-21]，其纤维蛋白基质结构更加致密，可捕获更多血小板和PDGF，同时支架属性好，可被高效降解，有利于组织再生，但其可塑性差，压制成膜后仍为质软的凝胶状物，对较大的创面填充效果不佳，且亦具有难以储存的局限性。

总体而言，PC在PDGF创面修复中仍面临诸多挑战，主要表现为：(1)不易保存，有效期短。(2)PDGF水平与活性血小板数量、制备时间、离心程序、激活剂种类等因素相关，由于目前尚无统一的PC制备标准，导致其质量参差不齐[22]。(3)PC多由自体血液采集制备而成，不适用于创面较大及不宜自体采血的患者。有报道[23-24]显示，可用异体PC进行替代治疗，疗效明显且无不良反应，但其安全性仍需验证。

2.2 PDGF与PL

对PRP进行裂解后，进一步释放细胞因子，去除白细胞及细胞碎片即可得到PL[6]，其含有更丰富的生长因子和更低的免疫原性，是进行异体创面修复的更优选择[25]。在4～10 ℃震荡条件下，PL可保存14 d，深低温时则可长期保存，具备批量生产、异体使用的可能性，但因保存条件严苛，院外无法便捷应用，加之由于血液来源紧张，可能面临原料不足的问题。有研究者发现，将过期血小板或PRP制成PL后，其生长因子含量及组织修复效能均无明显下降，一定程度上可满足异体创面修复的特定需求，缓解PL供应不足的局限性[25]。此外，PL可塑性强，可与干细胞、蛋白质、多糖等材料结合，形成高效的凝胶、纳米或3D生物工程创面修复产品[26]。笔者所在团队利用高活化专有培养技术获得了新型超活化PL(super-activated PL，sPL)[27]，其生长因子浓度是普通PL的数倍，可直接激活原位细胞，加速组织再生，可能成为血小板创面修复应用研究的发展方向。

2.3 PDGF与生物工程

生物工程技术的快速发展，为PDGF的应用研究提供了强大助力。重组人PDGF可解决PDGF来源不足的问题，而高动力递送系统的研发有望弥补重组人PDGF应用过程中效率低和副作用多的缺陷。通过对生物结构进行改造获得的转化型PDGF生物活性显著提高，尤其整合活性结构域得到的PDGF模拟肽，具有分子量小、可控性强的优势，极具应用潜力。

2.3.1 重组人PDGF

将PDGF-B基因整合至酵母等微生物遗传信息中可构建工程菌株，继而合成与内源性PDGF-BB生物活性相似的重组人PDGF-BB(recombinant human PDGF-BB，rhPDGF-BB)。1997年，以PDGF-BB为活性的Becaplermin凝胶通过美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)审批上市，允许将其应用于糖尿病相关创面的治疗。但由于创面基质金属蛋白酶的降解作用以致凝胶中的rhPDGF-BB半衰期缩短、局部驻留率降低，且因rhPDGF-BB进入血液循环后可导致脱靶效应，可诱发红斑性皮疹、蜂窝织炎及癌细胞转移等副作用，存在明显的应用缺陷，FDA于2008年对该制品的致癌风险提出黑框警告，加之费用高昂，导致临床应用受限。较差的递送动力学可能是造成重组人PDGF相关生物制品修复能力不足的主要原因之一。在生物工程技术的驱动下，利用蛋白质[28-30]、高分子聚合物[31]等原料设计的PDGF递送系统，具有强大的递送动力，可显著提高PDGF局部驻留率及信号传导强度。此外，时空控释是递送系统一个全新的亮点，其可模拟体内生长因子的生理释放顺序，进一步提升生长因子的创面修复性能。利用胶原蛋白及藻酸盐或由贻贝黏蛋白及缓释微粒构建的新型时空控释递送系统[30，32-34]可同时搭载多种生长因子，精准控制生长因子程序性释放，促进创面安全高效愈合。目前，PDGF高效递送系统的搭建在基础研究中已取得较为满意的进展，亟待大量可模拟人体损伤情况的模型进行长期观察，以验证其临床应用的可行性，并从中筛选出理想的递送系统进行后续应用研究。

2.3.2 转化型PDGF

信号传导是PDGF发挥生理活性的关键环节，提高信号传导强度可有效增强PDGF的生物活性。鉴于PDGF与细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)相互作用可协同促进PDGF信号传导，故提高二者的结合力可能是提升PDGF生物活性的有力途径[35]。将胎盘生长因子-2中与ECM蛋白高亲和力结合相关的结构域整合至rhPDGF-BB中，可获得与ECM蛋白超亲和的转化型PDGF，进一步证实了该策略的可行性[36]：在同等剂量下，转化型PDGF比野生型PDGF具有更显著的创面愈合能力，且其循环浓度不高，安全性得到保障；信号传导强度可通过PDGF与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Syndecans)的结合，实现在细胞表面水平的把控，触发更具可控性和持续性的信号形式，进一步增强PDGF生物活性。将层黏连蛋白α1链球状结构域嵌入rhPDGF-BB 的C末端构建转化型PDGF[13]，极大提升了PDGF与Syndecans蛋白结合的亲和力，可产生持续、低强度的强直信号，并减少受体脱敏，在显著改善PDGF稳定性的同时可提高其生物活性。值得警惕的是，对PDGF做“加法”，添加活性结构域获得的转化型PDGF，应用于创面修复是否会导致其他方面的风险仍需进行多维度安全性验证，与此同时尝试对PDGF做“减法”，得到的PDGF模拟肽亦为PDGF的创面修复提供了新的思路。

2.3.3 PDGF模拟肽

PDGF-BB作为PDGF家族中创面修复效应最强的亚型，由3个环(L1、L2和L3)连接4条链(β1、β2、β3和β4)形成了三维晶体结构[9]，每条链拥有两条高度扭曲的反平行β片，并在并列的β片末端通过环和C末端形成重要钳夹[37]，其中与PDGF-BB有丝分裂活性、高亲和力结合受体及肝素等功能相关的位点(如Arg160、Lys161和Lys162)位于钳夹内，功能位点所在区域的多肽(如残基157-162)可与PDGF受体竞争性结合，成为影响PDGF生理活性的重要功能结构域之一。研究者尝试提取PDGF的功能结构域，去除非必需肽，继而获得了PDGF模拟肽，其成本低、易于合成且质量与功能均可控[38-39]。PDGF模拟肽可通过扩展功能结构域设计提高其生物活性，进一步优化创伤修复性能。研究者利用残基153-162VRKIEIVRKK拷贝与自组装肽整合的模拟肽[11]，及环五肽-3 VRKKP序列共价连接Nap-FFG自组装基序形成的模拟肽[9]均具有良好的生物活性及稳定性。Deptua等[40]利用PDGF-BB结构中的L1片段组装的新型短肽在转录组水平未表现出毒性作用。上述研究提示，虽然PDGF模拟肽具有广阔的应用前景，但由于相关研究尚不充分，其对细胞和组织的毒性作用仍需警惕；且PDGF模拟肽目前主要通过化学合成获得，制备步骤繁琐，效率低，导致实际应用成本较高，加上新兴的模拟肽技术尚处于发展初期，无法模拟蛋白质的三级及四级结构，故PDGF模拟肽结构的缺失可能导致其无法完全复刻PDGF的特定功能，影响其创面修复能力。

2.4 PDGF基因递送

随着基因治疗技术的快速发展，将基因作为蛋白递送的替代策略已成为创面修复领域研究的热点。与蛋白相比，基因具有可诱导生物活性更精准的生长因子局部持续生产及不良反应更少等独特优势，将PDGF基因递送至创面局部并诱导被转染细胞高表达PDGF，可减少远超生理浓度PDGF应用时出现高水平PDGF非目标组织露暴导致的不良反应，且原位合成的PDGF可能具有更精准的生物活性结构，故该策略的创伤修复效能更强。局部基因递送策略旨在促进区域目标细胞安全高效表达促愈合因子，为保障应用的安全高效，PDGF基因递送应用条件需满足在触发特定靶细胞表达并维持一定治疗量PDGF水平的同时，不引起非目标效应，并能可逆性控制PDGF表达水平和时间。由于基因分子量大、电荷密度高、细胞渗透性低，需借助载体以提高转染效率，故研发安全高效的输送载体成为基于PDGF基因递送策略进行创面修复的关键。然而目前的基因递送策略因无法避免基因表达超时引起插入突变的问题，加之机体对载体的免疫响应等均限制了该策略的应用。以免疫原性较低、安全性较好的干细胞、ECM、蛋白质等为材料建立基因转染载体的研究正在如火如荼地开展[41-43]，其最大化降低了免疫事件的发生风险，并在创面模型中均表现出令人期待的转染效能，同时可实现多基因转染[44]，以进一步提高创面修复效能。时空控释支架有望成为精准控制基因表达的切入点，研究者利用胶原模拟肽在创面模型中实现了对基因表达的时空控释[42]，但其能否在人体创面中稳定发挥作用尚需验证。若可突破控制PDGF基因时空表达技术的壁垒，基因递送有望取代蛋白成为创面修复的首选。

3 小结与展望

创面问题影响着数百万患者，给全球医疗系统带来了巨大的经济负担和社会挑战。作为一种多功能细胞因子，PDGF可通过启动细胞增殖、分泌等效应过程，有效促进创面修复，因而研发以其为活性的创面修复方法成为创伤修复、医疗美容等领域研究的热点。通过降低PDGF循环浓度、增加其局部驻留率、提高有效浓度、延长作用时间及增强生物活性等多举措，在保障PDGF应用安全性的同时可显著提高其有效性。基于血液获得的富含PDGF的血小板制品，由于存在保存条件苛刻、作用时间短、生物利用率低、来源受限等局限性，影响了其临床广泛应用。生物工程技术的发展催生了多种PDGF应用策略，如重组人PDGF、转化型PDGF、PDGF模拟肽等，并构建了多种安全、高效、具备PDGF时空控释能力的递送系统，在创面修复中的应用前景广阔。局部应用PDGF基因转染创面细胞以局部合成PDGF的疗法，搭载时空控释支架可实现对PDGF基因表达的精准调控，有望替代PDGF蛋白递送成为创面修复的理想选择。虽然PDGF创面修复应用相关研究仍处于基础实验阶段，相信随着临床转化领域不断取得突破，PDGF在创面修复中的应用将会更加广泛。