噬菌体清除沙门氏菌生物被膜应用研究进展

郝柳杭，谢自强，宋瑞铭，尹鼎泽，李 悦，黄洋铃，张占丽，张永英*

（ 1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056000 ；2. 西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100 ； 3. 馆陶县农业农村局，河北 邯郸 056000 ）

沙门氏菌在自然界中广泛分布，是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌不仅以感染畜禽作为传染源，通过水平传播和垂直传播两种方式在动物间传播，还可通过食品等途径感染人，从而引起食源性疾病[1]。自然界中，沙门氏菌大多以生物被膜形式存在，附着于饮水设备、医疗设备、食品加工设备等载体表面，约80%的慢性感染均与生物被膜的形成有关[2]。由此可见，沙门氏菌生物被膜是造成公共卫生安全事件的主要因素之一。生物被膜结构复杂，细菌细胞被自身产生的胞外聚合物（EPS）包围。EPS结构不仅增强了其抵抗吞噬细胞、杀伤细胞的能力，也妨碍了细菌与抗菌药物和细菌菌团的接触，导致细菌耐药性产生。与浮游态沙门氏菌相比，生物被膜形态沙门氏菌更难清除[3]。因此，研究新型安全无污染生物被膜的清除剂刻不容缓。在禁抗背景下，噬菌体因具有抗菌作用而受到了广泛关注。噬菌体侵染宿主菌时，自身编码的解聚酶和溶素可降解多糖和肽聚糖，破坏EPS结构，裂解生物被膜。同时，解聚酶还可降解细菌细胞壁上的多糖化合物，破坏细胞壁结构，帮助噬菌体与宿主菌结合，更好地裂解宿主菌[4]。本文总结了沙门氏菌生物被膜、噬菌体的研究进展，总结噬菌体裂解细菌生物被膜的作用机制及相关应用，以期为噬菌体在沙门氏菌临床防控中的进一步应用提供参考。

1 沙门氏菌生物被膜的相关研究进展

1.1 沙门氏菌生物被膜形成

自然界中，沙门氏菌大多以生物被膜（biofilm）的形式存在。生物被膜是由微生物的细胞及其分泌的聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）所组成的多细胞复合体，在微生物的生长过程中附着于载体的表面而形成[5]。生物被膜的形成极大地提高了沙门氏菌在自然环境中的生存能力[3]。EPS对生物被膜的稳定性具有很大的影响，其主要组成成分为多糖和肽聚糖[6]。此外，载体材料、胞外多糖、胞外蛋白、胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）在生物被膜形成过程中也发挥了很大的作用，是维持生物被膜稳定性的重要组成部分。生物被膜形成和发展过程可分为5 个阶段：黏附、定植、发育、成熟、主动扩散[7]。不同阶段的细菌具有不同的特点，黏附期细菌为可逆地吸附到物体表面，但当细菌到达定植期时，吸附作用转变为不可逆，而后逐渐产生更难清除的EPS结构和三维结构[8]。

1.2 沙门氏菌生物被膜形成的影响因素

生物被膜的形成因子可分为与细胞表面相关和胞外分泌两大类，其中与细胞表面相关的因子包括鞭毛、菌毛、功能性蛋白质等；与胞外分泌相关的包括胞外多糖、蛋白质、eDNA、eRNA 等[7]。不同组分在生物被膜形成过程中起到不同作用，以下主要介绍5种组分的作用。

（1）鞭毛：在生物被膜形成的初始阶段，需要依靠鞭毛的运动性[9]。生物被膜形成过程中的鞭毛功能可在两个阶段进行调节：在组装阶段可通过一系列转录调节因子进行调节；在组装后阶段可通过效应蛋白和运动蛋白之间的相互作用进行调节[10]。鞭毛存在于生物被膜形成的各个阶段，并在生物被膜的结构中形成类似支架的结构，比缺乏鞭毛的生物被膜结构更难清除[11]。

（2）菌毛（fimbriae）：肠杆菌科中的Ⅰ型菌毛（fimACDH基因簇）和Ⅲ型菌毛（mrkABCD基因簇）在细菌生理学中起到多种作用，包括附着、侵袭、细胞运动以及生物被膜形成[12]。Guo等[13]在123株大肠杆菌强阳性菌株中检测到49.59%菌株含有mrkABCD基因簇，14.64%菌株含有fimACDH基因簇；而将强阳性菌株中的mrkABCDF和fimACDH基因簇克隆并导入中等阳性菌株质粒载体内，最终中等阳性菌株均转变为强阳性菌株。

（3）胞外多糖：胞外多糖是EPS的主要组成成分，对生物被膜形成具有重要影响[14]。胞外多糖有助于生物被膜附着于载体表面，帮助钙镁离子结合，使生物被膜结构更加紧密，抵御抗菌剂渗透[15-16]。一些清除生物被膜的酶制剂也是依靠溶解生物被膜EPS 中的多糖骨架清除生物被膜[17]。

（4）蛋白质：外膜蛋白（outer membrane protein，OmpS）不仅是细菌重要的毒力因子，对细菌的黏附、侵袭、生物被膜形成、生物被膜结构的稳定也具有重要作用[18]。外膜蛋白的β-桶状蛋白结构使其在生物被膜中具有极高的稳定性，使生物被膜能够抵抗恶劣环境[19]。

（5）eDNA：eDNA 结构主要由DNA 结合蛋白家族（DNABII）中整合宿主因子（integrated host factor，IHF）和组蛋白样蛋白（histone-like protein，HP）维持[20]。这些蛋白质在细胞外是稳定eDNA交叉链结构的关键蛋白，而稳定的eDNA 结构在生物被膜EPS 结构中类似霍利迪连接（Holliday junctions），增强了生物被膜稳定性[21]。Rocco等[22]用特异性抗体靶向去除DNABⅡ蛋白后，发现生物被膜清除效果明显。Buzzo 等[23]研究表明，eDNA 为罕见的Z 型DNA，随着生物被膜的生长而积累，并在积累过程中完善生物被膜结构的完整性，促进生物被膜形成。

1.3 沙门氏菌生物被膜的危害

以生物被膜形态存在的细菌可黏附于各种载体表面，而当微生物所处环境发生变化时，生物被膜内细菌可由一个微菌落转移到另一个细菌中，从而脱离生物被膜进行扩散。由于生物被膜的形成是动态过程，且各细菌的发展位于不同的时间和空间，所以其生理活性和基因表达具有不均质性[8]，并使生物被膜具有复杂的结构和代谢方式[24]。此外，生物被膜的不均质性导致生物被膜亚群之间具有生理性的异质性，与浮游细胞相比，生物被膜结构更难清除，也更具有抗性[5]。Wang等[25]研究表明，与浮游形态中存在的沙门氏菌相比，以生物被膜形式存在的沙门氏菌对抗菌剂的敏感性更低。细菌形成生物被膜后，由于外部黏性基质的保护，杀菌药物仅能杀死生物被膜表层细菌和浮游细菌，因此其抵抗吞噬细胞、杀伤细胞等的能力大大提高。同时生物被膜活性较低、生长较慢的特性促进了抗生素耐药基因交换，更易诱导细菌产生抗生素耐药性[26]。沙门氏菌生物被膜形成对于沙门氏菌的生存具有重要作用。

1.4 传统生物被膜的清除方法

生物被膜的清除方法已成为当下研究的一大热点，常见的有物理方法和化学方法和微生态制剂法。

生物被膜很容易黏附于医疗器械、生物管腔、器官表面等，且难以清除。孙惠惠等[27]研究内镜硬式管腔生物被膜清除方法时，利用40 kHz 超声波清洗内镜管腔，铜绿假单胞杆菌清除率达99%。Carmen等[28]研究表明，超声波促进了庆大霉素导入大肠杆菌生物被膜。生物被膜外部黏性基质阻碍了抗菌药物的导入，但是超声波可促进抗生素导入，提高了抗菌药物对于生物被膜的清除效果。超声波法对生物被膜具有良好的清除作用，但与仪器管腔不同，养殖场常见饮水管道长，且常位于地底或墙内等位置，不易于超声波清除生物被膜。

抗生素、消毒剂等是常见的清除生物被膜的方法[29]。养殖人员会施用沙门氏菌敏感抗生素或消毒剂清除沙门氏菌生物被膜[30]，但由于生物被膜外部黏性基质对生物被膜的保护作用可阻碍抗菌药物导入，抗生素或消毒剂往往只能作用于生物被膜表层细菌，不能破坏生物被膜的EPS结构，无法清除生物被膜[31]。

益生元和抗菌肽等是常见的防控沙门氏菌的生物制剂，可有效防止沙门氏菌定植，避免生物被膜形成，但二者发挥效用的条件比较苛刻，制造成本较高，不适用于环境中生物被膜的防控与清除[32-33]。

随着沙门氏菌耐药问题日益严重，寻找一个新型、有效、安全、方便的抑制生物被膜形成和裂解沙门氏菌生物被膜的方法具有重要的现实意义。

2 噬菌体及其裂解生物被膜的作用

2.1 噬菌体的特性及应用进展

噬菌体是一种特殊的细菌“病毒”，可将宿主菌裂解。自然界中，有细菌生存的地方就有噬菌体的存在，数量十分庞大。噬菌体可分为裂解性噬菌体和温和性噬菌体，裂解性噬菌体可特异性地感染某些细菌，并将其裂解；温和性噬菌体也称作溶原性噬菌体，是将自身DNA 与宿主菌的DNA 整合，使其与宿主菌的DNA 一同复制，这个过程也可称作“溶原转换”[34]。噬菌体具有较高的温度耐受力和较强的耐酸性，且尚未发现噬菌体会对生物机体产生明显毒性，因而对噬菌体药物的研究具有可行性[35]。

1921年，学界第一次报道了人类疾病治疗中应用噬菌体[36]。但由于抗生素的发展与使用，噬菌体的研究被慢慢搁置。近年来，日益严重的耐药性问题使得噬菌体疗法重新被人们重视，许多研究人员开始利用噬菌体治疗细菌疾病。目前，噬菌体疗法主要分为全噬菌体疗法与裂解酶制剂疗法两个方向[37]。噬菌体疗法还应用于沙门氏菌、大肠杆菌、弯曲杆菌等多种细菌性疾病的治疗中[38-40]。

2.2 噬菌体裂解细菌生物被膜机制

噬菌体复制需要依赖宿主细菌，当噬菌体侵染细菌时，自身编码多种酶，损害细菌的屏障。虽然噬菌体可能受到EPS基质的影响，但其编码的解聚酶和溶素可降解多糖和肽聚糖，从而破坏EPS结构，协助噬菌体传播，裂解细菌生物被膜[6]，因此噬菌体仍然能够在生物被膜内传播和复制，避免生物被膜的抗吞噬性，从而更好地杀灭细菌[41]。当增殖周期结束时，噬菌体会在宿主细胞内合成内溶素，直接靶向细菌细胞壁的肽聚糖（peptidoglycan，PG）中的键，特异性地裂解细菌[42]；解聚酶还可识别、结合、降解细菌细胞壁上的多糖化合物，破坏细菌细胞壁结构，暴露受体，使噬菌体更易与宿主菌结合[43]。

2.3 噬菌体裂解细菌生物被膜的应用

2.3.1 噬菌体裂解细菌生物被膜在外部环境中的应用

生物被膜具有黏附特性，在饲料储存场所、饲料传送带、饮水管道等多处饲料饮水可接触表面可以检出沙门氏菌。Korzeniowski 等[44]在试验中利用噬菌体清除96 孔板和不锈钢表面的沙门氏菌生物被膜，结果发现清除率分别为32%～69%和52%～98%。有研究发现，噬菌体可显著减少96孔板（32%～69%）和不锈钢表面（52%～98%）的沙门氏菌生物被膜，此外，他们通过人工感染家禽饮水器，来模拟自然界中沙门氏菌生物被膜的形成环境，发现噬菌体不仅显著减少饮水器表面的沙门氏菌数量，还通过饮水来治疗家禽沙门氏菌体内感染[45]。Gong 等[46]在研究噬菌体清除工人靴子上的沙门氏菌污染时，通过对比研究实验室条件和工作环境中沙门氏菌生物被膜的清除效果，发现在实验室条件下，经噬菌体处理，橡胶鞋底模板和靴子上沙门氏菌生物被膜分别减少了95.100%～99.999% 和91.5%～99.2%；在工作环境中，经噬菌体、噬菌体+次氯酸钠和噬菌体+擦洗等3 种处理后，工人靴子上的沙门氏菌数量分别减少了84.2%、92.9%和93.2%。两次结果均表明噬菌体可有效减少工人靴子上的沙门氏菌污染。

2.3.2 噬菌体裂解细菌生物被膜在细菌性疾病治疗中的应用

Song 等[47]在噬菌体清除金黄葡萄球菌生物被膜的研究中表明，噬菌体不仅可清除金黄葡萄球菌生物被膜，还会在侵染细菌的过程中成倍增加，使其裂解生物被膜、杀灭细菌的能力大大增强。医院常见粪肠球菌感染，常附着于各种医疗设备，传播范围广，研究人员利用噬菌体清除耐万古霉素粪肠球菌生物被膜，发现生物被膜生成量减少了2/3，提示噬菌体可有效去除耐万古霉素粪肠球菌生物被膜[48]。Kunz 等[49]尝试将噬菌体与抗生素联用清除多重耐药粪肠球菌生物被膜，分别利用氨苄青霉素、达托霉素、氨苄青霉素+达托霉素、单噬菌体、噬菌体混合物、噬菌体+抗生素组合的方法分析达托霉素耐药菌株生物被膜的清除效果。结果表明，最佳清除方案为达托霉素+氨苄青霉素+噬菌体混合物，可完全清除生物被膜形态的粪肠球菌，且氨苄青霉素与任何噬菌体联用均可呈现良好的生物被膜清除效果。Esmael等[50]研究发现，噬菌体混合物可减少鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌生物被膜的形成。Webber等[51]研究发现，单一噬菌体或噬菌体鸡尾酒均可减少沙门氏菌生物被膜的形成，噬菌体鸡尾酒的能力更加显著，清除率可达83.4%。

2.3.3 噬菌体裂解细菌生物被膜在食品行业中的应用

消除食品中沙门氏菌及其生物被膜的方法主要是使用杀菌剂、化学消毒剂、热处理或其他特殊防腐剂，但这些方法不仅会影响食物的食用口感，甚至会造成化学试剂残留，进而影响人类健康。

近年来，许多学者对噬菌体减少食品中沙门氏菌污染进行研究。在水、牛奶、鸡胸肉、洋葱等常见食品的研究中发现噬菌体可有效减少食品中沙门氏菌活菌数[52-53]。沙门氏菌常通过食品污染传播，为应对沙门氏菌的食源性污染，研究者尝试在饲料中添加噬菌体以期减少动物体内的沙门氏菌。Thanki 等[54]将噬菌体喷雾干燥制成粉末状态与饲料混合，结果显示，预防性地使用干噬菌体能够减少沙门氏菌在仔猪胃、十二指肠、结肠和盲肠中的定植，且不会影响仔猪健康。Kimminau 等[55]研究表明，饲料中添加噬菌体也不会影响沙门氏菌活疫苗的功效。

传统生物被膜清除方法存在耐药问题、成本高、操作复杂、不适合畜牧业批量应用等缺点，在后抗生素时期，噬菌体作为一种清除沙门氏菌生物被膜的生物防治剂，效果良好，而且噬菌体感染周期短，增殖迅速，小剂量的噬菌体制剂即可清除宿主细菌[56]。噬菌体培养成本较低、适应性强、分布广泛，发生肠炎沙门氏菌病传播的地区往往能够检测到特异性噬菌体的存在[57-58]。目前针对噬菌体应用研究中实际应用的产品很少，且多用于治疗细菌性疾病，因此利用噬菌体清除沙门氏菌生物被膜拥有巨大潜力。

3 结论

沙门氏菌广泛存在于自然界中，患病动物排泄物增加了沙门氏菌环境污染程度，环境中沙门氏菌常以生物被膜的形式存在，相较于浮游态，生物被膜形态沙门氏菌更难清除。噬菌体作为新型减抗替抗产品，其自身编码的解聚酶和溶素不仅可以特异性地裂解宿主菌，还能够破坏EPS结构，裂解生物被膜。同时，由于噬菌体具有培养成本较低、适应性强、分布广泛的特点，可以在清除环境中沙门氏菌生物被膜中发挥良好的效果，利用噬菌体清除沙门氏菌生物被膜拥有巨大潜力。