免疫胶体金技术及其在兽医临床中的应用研究进展

王中海

（ 甘肃省和政县农业农村局，甘肃 临夏 731200 ）

免疫胶体金技术是一种以胶体金为示踪标志物，应用于抗原抗体的新型免疫标记技术[1]，可对血清及尿液进行检测，且检测时间很短，通常只需5～10 min即可完成检测。免疫胶体金技术作为临床中常见的一种标记技术，近年来逐渐发展成熟，并在多个领域得到了应用，兽医临床也开始广泛使用免疫胶体金技术诊断多种疾病。目前，胶体金免疫层析技术和斑点金免疫渗滤法是免疫胶体金技术最常见的两种应用类型。本文总结了免疫胶体金技术的应用类型，探究其应用优势，阐述其在兽医临床中的应用进展，以期为免疫胶体金技术在兽医临床中更加广泛的应用与研究提供参考。

1 免疫胶体金技术的应用类型

1.1 电镜标记技术

1962年，有研究首次提出使用胶体金作为一种电镜示踪标志物，其具有的球形外观和高电子密度能够在图像中得到较为清晰的显示，可轻松地分辨胶体金和抗原。胶体金颗粒大小直径在3～150 mm，根据使用者采取的制备方式，最终得到的胶体金颗粒大小也会有所不同[2]。电镜标记技术具有灵敏度高、特异性强和定位精确等特点，还可对抗原进行定量、定性、定位的分析与观察。应用ICG 双重或多重标记法，可将形态、功能和结构的研究融为一体，有助于了解同一组织或细胞内不同分子的相互关系及其合成、分泌、转运等代谢过程。通过胶体金免疫电镜观察，单个和个别堆集的病毒颗粒周围有许多金颗粒附着，金颗粒出现强烈反差，因此，观察时找到金颗粒聚集的地方即可找到病毒颗粒，表明该技术具有简便、快速、灵敏直观等特点，大大提高了检测效果[3]。

1.2 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是近年来临床中广泛应用于诊断多种疾病的新技术，该技术同样使用胶体金为示踪物，其中最常用的是免疫胶体金层析试纸条（ICTSs）[4-6]。胶体金免疫层析技术作用原理是通过硝酸纤维素膜上毛细管的作用，样品滴入后随着硝酸纤维素膜上移，定位在纤维素膜上的受体与待测样品结合，产生特异性反应；抗原和抗体的复合物不断积累，胶体金的标志物通过沉淀显示出颜色，以此实现检测目的。胶体金免疫层析技术最初应用于检测人绒毛膜促进性腺激素（HCG），随着医学技术进步，近年来该技术的应用范围越来越广。胶体金免疫层析技术具有快捷迅速、安全简便、灵敏准确、成本低廉的优势，但由于免疫层析是肉眼水平的免疫检测，因此只能提供定性结果；其次，检测的准确度受到抗体质量影响较大。

1.3 斑点金免疫渗滤法

斑点金免疫渗滤法又称滴金免疫测定法，该方式将胶体金作为标志物，能够在不对样品的蛋白质生物活性造成影响的前提下开展测试，具备良好的稳定性。与免疫层析法相比，两者具备相似的作用原理，但斑点金免疫渗滤法的过滤方式是液体过滤，过滤过程更顺畅，检测效率也更高。斑点金免疫渗滤法不受环境温度影响，检测时间短，省去了酶标底物反应过程，但渗滤装置复杂、成本较高。

1.4 液相免疫测定

通过结合胶体金与抗体建立微量凝集试验检测相应的抗原，肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理建立的均相溶胶颗粒免疫测定法（sol particle immunoassay，SPIA）已成功应用于检测PCG，直接应用分光光度计进行定量分析[7-9]。液相免疫测定不仅用于分离简单化合物，还用于从细胞混合物中分离特定蛋白质。蛋白质与抗体结合，剩余的溶液通过柱子，然后使用另一种溶液释放蛋白质并收集。这需要高度熟练的技术人员随时监控色谱柱并确保该过程完全按计划运行，才能保障检验的顺利进行。

1.5 金标记流式细胞术

胶体金可明显改变红色激光的散射角。有研究利用胶体金标记的羊抗鼠Ig 抗体应用于流式细胞术分析不同类型细胞的表面抗原；结果显示，胶体金标记的细胞在波长632 nm下，90度散射角可放大10倍以上，而且不影响细胞活性，与荧光素共同标记时彼此互不干扰[10]。流式细胞术的优点在于拥有强大的分选功能，能够在分析的同时分选特定群体，还可对多种类样品进行检测，检测速度快、样本多。但其检测的样品必须为单细胞悬液，限制较大。

2 免疫胶体金技术的应用优势

免疫胶体金技术的操作十分简单，只需要通过专门的试剂盒或试剂条即可进行样品的检测，不要借助其他仪器及设备、试剂等，大大缩短了检测的时间和流程。其次对于样品的要求不高，通常只需在检测前对样品进行简单处理，甚至不需要处理即可进行检测。能够应用于检测的样品也十分多样，除了常见的血清外，还可使用组织液、粪便、尿液等进行检测，极大地方便了样品检测，促进检测流程的简单化。常规检测诊断技术需要经过复杂仪器的种种检验，且检测过程需花费数小时，而免疫胶体金技术十分方便快捷，只需5～10 min 即可得到结果。与其相似的ELISA技术相比，同样是选用试剂盒或试剂条的形式进行检测，ELISA 诊断得到结果需要1～2 h，PCR 所需时间更长，由此可见，免疫胶体金技术的诊断效率更高[11]。同时免疫胶体金技术对于检测环境的要求不高，能够在日常生活环境中使用，受到场地限制较小。方便快捷的同时又能够保障灵敏度。成本低也是免疫胶体金技术的另一项显著优势，一方面本身的试剂盒或试剂条较为实惠，另一方面是因为胶体金技术的检测结果十分显著，通常检测者只需要通过肉眼观察就能够直观地看到检测结果，而不需要借助显微镜以及一些特殊设备，缩小检测者的使用成本。免疫胶体金技术具有明显的特异性，在不同的检测条件下仍然能够保障检测结果的准确性。其次在检测的过程中能够同时对各个项目进行检测，有利于提升样品的使用率，减少检测过程中的浪费。

3 免疫胶体金技术在兽医临床中的应用

3.1 免疫胶体金技术在病毒病诊断中的应用

免疫胶体金技术在兽医临床中得到广泛应用，其中对于各种疾病的诊断具有良好效果。在对病毒病的诊断中，李华斌[12]选择单抗3A4为金标抗体，单抗4F11作为检测线抗体，羊抗鼠二抗为质检抗体，制备了猫杯状病毒（FCV）抗原检测胶体金试纸条。组装的试纸条对3种常见的猫病毒FCV及其他3种常见的猫病毒：猫细小病毒毒株（FPV）、猫疱疹病毒毒株（FHV）及猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）进行检测,显示特异性良好，无交叉反应；与RT-PCR 方法同时对94 份猫鼻咽拭子进行检测，符合率在90%以上。杨晓童[13]分离了7 株新型鹅星状病毒，制备了抗新型鹅星状病毒的单克隆抗体和多克隆抗体，并建立了针对新型鹅星状病毒的胶体金层析检测方法。该方法最低检出病毒量为1.2 mg/L，除新型鹅星状病毒检测结果为阳性外,常见禽源病原DAst V、GPV、H9-AIV、FAd V-4、DHAV-3 和TMUV 等检测结果均呈阴性，无交叉反应；使用不同批次的试纸条均能够检出病毒，且与PCR 方法的符合率为92.5%。此外，在25 ℃室温条件下该试纸条可稳定保存3 个月，4 ℃条件下可稳定保存5 个月，提示ICTSs 的稳定性较优。李书剑[14]制备的ICTSs能够准确、简便、快速地检测C 型逆转录病毒禽网状内皮组织增生症病毒抗原，5～15 min 即可得到结果，不需要专业的设备和技术，适用于基层兽医部门等不同单位对禽网状内皮组织增生症病毒的快速检测，且成本低廉，经济效益良好。2018年，非洲猪瘟首次在我国发生，随后各地陆续出现疫情，对我国养猪业造成一定影响。该病的蔓延也对兽医临床诊断技术提出了新的要求，ICTSs 特异性、敏感性和稳定性良好，也成为临床诊断非洲猪瘟的一种方法[15]。崔鹤馨等[16]在探究梅花鹿黏膜病病毒的快速检验方式中，尝试研发免疫胶体金试纸条，最终结果显示免疫胶体金技术的检测效率高，对黏膜病病毒实现了有效鉴别，能够达到快速检测的效果。由此可见，免疫胶体金技术能够为畜禽病毒性疾病提供有效的诊断技术，实现临床的快速诊断。

3.2 免疫胶体金技术在细菌病诊断中的应用

有报道总结，免疫胶体金技术可临床诊断布鲁氏菌、牛分枝杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、鸭疫里默杆菌、鳗弧菌、出血性大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、副鸡禽杆菌、空肠弯曲菌、炭疽杆菌、李斯特菌、土拉热弗朗西斯菌、破伤风杆菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌等多种细菌病[17]。韩文龙[18]研制了鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体和免疫胶体金检测试纸条，研制的试纸条可用于细菌培养物中鸭疫里默氏杆菌的检测和鸭疫里默氏杆菌感染病鸭的临床快速诊断，而且使用试纸条检测感染鸭心脏组织样品的检出率高于组织样品细菌分离鉴定的结果。王海丽等[19]在猪种布鲁氏菌S2 株外膜蛋白OMP25 表达纯化的基础上，对金黄色葡萄球菌蛋白A进行胶体金标记，并喷涂于玻璃纤维上，制备了布鲁氏菌抗体检测胶体金免疫层析试纸条。该试纸条对羊布鲁氏菌病阳性血清具有高度特异性，灵敏度与ELISA相当，在4 ℃条件下可保存9个月，室温条件下可保存6 个月。杨松鑫等[20]基于Tris 辅助法制备均匀度好、稳定性强的胶体金，优化试纸条的最适pH 值、蛋白量和重悬比，建立的沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条敏感性高、特异性好、重复性好，各方面性能均达到临床快速检测要求。陈诗胜[21]开发了检测奶牛乳房炎主要致病菌的PCR核酸免疫层析试纸条，不需要进行核酸扩增后的凝胶电泳复杂操作环节，检测方法更加安全、简单、快速、便捷、廉价，可作为替代核酸凝胶电泳的新方法。

3.3 免疫胶体金技术在寄生虫病诊断中的应用

寄生虫病作为动物疫病的主要病症之一，不仅会对动物的生活及生命安全造成影响，也可能会传染人，因此必须注重对动物寄生虫病的诊断，及时遏制传染趋势。寇金华等[22]制备1种检测猪弓形虫血清循环抗原的免疫胶体金试纸条，试验利用柠檬酸三钠还原法制备40 nm的胶体金溶液，标记抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体（Anti-ASAG3-7），用另1 株抗弓形虫表面抗原SAG3 单克隆抗体（Anti-A-SAG3-23）与羊抗小鼠IgG抗体分别包被检测线和质控线，制备并优化免疫胶体金试纸条检测条件。试纸条的灵敏度达1∶160，与猪囊虫阳性血清无交叉反应，置于室温至少可保存1个月有效，置于4 ℃可保存3个月有效。对广东某地区、吉林某地区猪场的各94份猪待检血清进行检测,样品阳性率为18.08%、10.63%。赵阿普[23]在对猪旋毛虫病的诊断中同样应用了免疫胶体金技术，研究结果显示，与常规检测方式相比，免疫胶体金的检验准确度高且成本低廉、易操作。邰利鑫[24]选用实验室制备保存的微小隐孢子虫病毒单克隆抗体作为捕获抗体，制备兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体作为检测抗体，制作检测牛粪便样品中是否存在微小隐孢子虫感染的胶体金试纸条，并与双抗夹心ELISA、Dot-ELISA 检测方法进行对比分析，为牛微小隐孢子虫的动态监测提供参考。金程佳[25]将DLC2蛋白对检测线进行划线，以SPA 为标志物进行偶联胶体金，质控线以1 mg/mL 鸡抗SPA 二抗进行划线，建立华支睾吸虫病胶体金免疫层析法。该方法与日本血吸虫、肝片吸虫、日本棘隙吸虫阳性血清均不发生交叉反应，特异性较好，可用于临床样本的快速诊断。试验还采用该方法对临床样本进行了检测，结果显示宠物医院样本中阳性率为2.1%，流浪犬阳性率为5.6%，也为当地犬华支睾吸虫感染情况提供了数据资料。

3.4 免疫胶体金技术在兽医其他领域中的应用

除了对疾病的检测外，胶体金层析技术在食源性致病菌如大肠埃希氏菌O157、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌等方面也有大量应用研究[26]，还可检测乳中是否存在雌二醇[27]、环丙沙星等[28]的残留。随着饲料工业不断发展，免疫胶体金技术也开始应用于饲料中霉菌毒素（如黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等）的检测[29-32]。

4 结论

免疫胶体金技术作为一项发展成熟的检疫技术，具有操作简单、方便快捷、成本低、特异性强等多种优势，因此在各个领域中得到了广泛应用。将免疫胶体金技术应用于兽医临床及畜牧生产中能够实现对病原的快速诊断及目标物质的快速检出，从而推动我国畜牧养殖业的发展。