红外光谱结合化学计量学鉴别中药白及和其伪品“水白及”*

刘想晴 程旺兴 秦亚东

(1安徽中医药高等专科学校药学系 安徽芜湖 241000；2安徽中医药大学药学院 安徽合肥 230012)

白及始载于《神农本草经》[1]，药用历史悠久，疗效显著，来源于兰科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎；具有收敛止血，消肿生肌的功效，常用于咯血，吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂[1]。白及中主要含有2-异丁基苹果酸葡萄糖氧基苄酯类、联苄类、蒽醌类、螺环烷甾类皂苷、菲类、葡萄糖苷类、类胡萝卜素等成分，其中2-异丁基苹果酸葡萄糖氧基苄酯类是兰科植物含有的具有特殊结构的化合物[3-5]。

白及应用广泛，主要集中在医药、美容、保健等领域，市场需求量较大，资源相对紧缺，导致大量混伪品出现。目前，市场上出现的白及混伪品统称为“水白及”，据文献记载，“水白及”多来源于兰科天麻属(Gastrodia)、杜鹃兰属(Cremastra)、美冠兰属(Eulophia)、筒瓣兰属(Anthogonium)、舌唇兰属(Platanthera)、独蒜兰属(Pleione)、美冠兰属，百合科黄精属(Polygonatum)、知母属(Anemarrhena)等属的多种植物在不同地区作为白及的混伪品使用[6-7]。“水白及”多为白及的近属植物，其性状特征与白及十分相似，容易造成混淆，运用红外技术建立白及和“水白及”鉴别的方法具有一定是价值和意义。

常见的白及的传统鉴定方法主要包括性状鉴别、显微鉴别和理化性质鉴别[8-10]，已有学者报道白及的DNA鉴别[11]、近红外光谱[12]等，但尚未见红外光谱结合化学计量数在白及和“水白及”鉴别中的研究。鉴于此，该研究对白及和“水白及”共37批样品的红外光谱进行自动基线校正、平滑，二阶求导等处理，进一步进行系统聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，快速鉴别白及和“水白及”，为白及的开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂

傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet iN10 MX)、DTGS 检测器、SMART ITR附件：美国Thermo Fisher Scientific 公司、高速多功能粉碎机：合肥亿心程试验设备有限公司；无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；实验所用试剂均为分析纯。

1.2 样品来源与制备

白及及“水白及”样品主要来源于安徽、云南、四川、贵州、广西、湖南等地，除少量自采以外，样品多采购于药材市场，详细信息见表1。按照2020版《中国药典》采收要求，将37批样品，晒干，打粉，过80目筛备用，置4℃冰箱中保存。

表1 样品信息

2 方法

2.1 数据采集

精密称取1.2节中制备的白及、“水白及”样品粉末，平摊于SMART ITR附件的金刚石上，旋转附件旋钮将样品固定，压成透明薄片。利用傅里叶变换红外光谱仪，在4000～525cm-1范围内采集红外光谱，样品压片累积扫描16次，扫描速度为0.2 cm/s，间隔4cm-1，过程实时扣除H2O和CO2的干扰。

2.2 数据分析

采用OriginPro 2019软件对白及和“水白及”共37批样品的红外光谱进行自动基线校正、平滑，并绘制红外光谱图，详见图1和图2。再取样品红外光谱的平均图谱作为红外标准图谱，并进行二阶导数处理，得到相对应的二阶导数红外光谱图，运用Origin软件进行自动寻峰，导出数据，得到峰位、峰强等信息。基于红外光谱数据，运用SPSS 26.0软件进行系统聚类分析(HCA)，使用SIMCA 16.1软件进行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。

图1 19批白及的红外光谱图谱

图2 18批“水白及”的红外光谱图谱

3 结果与分析

3.1 红外光谱图分析

从图1中19批白及的红外光谱图谱可看出，白及样品红外光谱图的峰形、峰位、峰高基本相似。如图2所示，由于18批 “水白及”的来源不同，其红外光谱图在锋形、峰位等方面存在一定的差异，粗略的可以分为3组，具体图谱如图3中B、C、D所示。19批白及药材的红外指纹图谱相似(图1所示)，主要吸收峰位于3366～3360、2977～2975、2932～2930、2894、2365～2362、2164、2025～2023、1976、1681～1679、1632、1587～1583、1526～1524、1450～1448、1386～1384、1326～1324、1268～1266、1226～1225、1147～1145、1087～1085、1050～1047、1007～1005、930～928、884、571～569cm-1等处。3363 cm-1附近强而宽的吸收峰为糖苷甾醇类、多糖、皂苷类化合物中O-H伸缩振动峰。2930 cm-1附近吸收峰为C-H伸缩振动峰；1679 cm-1处附近吸收峰表征为羰基C=O伸缩振动；1632 cm-1处附近吸收峰表征为N-H弯曲振动；1583、1525、1450 cm-1为苯环骨架C=C伸缩振动，可能为联苄类、蒽醌类、菲类化合物的吸收峰；1324 cm-1附近吸收峰为C-0伸缩振动峰；1267 cm-1可能是C-O伸缩振动和C-H弯曲振动的叠加，多为糖苷类、脂类、多糖类中C=C骨架C=O-C伸缩振动；1147 cm-1附近吸收峰为-COOH弯曲振动；1048、1006、928 cm-1附近由多个吸收峰重叠成的宽强峰，为多糖、苷类等碳水化合物的C-O伸缩振动。[13-16]

18批“水白及”红外指纹图谱(如图2所示)，从整体上看具有较高的相似，由于市场上的“水白及”具有多个不同来源，其红外光谱图在峰形、峰位等方面存在一定的差异，粗略的可以分为3组，具体图谱如图3中B(S1、S3、S5、S7、S11)、C(S2、S4、S17)、D(S6、S8、S9、S10、S12、S13、S14、S15、S16、S18)所示。白及和“水白及”在4000～1800 cm-1区红外指纹图谱吸收峰稀少，在吸收峰的个数、峰形、峰位等方面基本一致，共有8个共有吸收峰。白及和“水白及”在1800～800 cm-1区的红外指纹图谱吸收峰较为密集，除去在1453～1444、1387～1381、1332～1324、1091～1083、1051～1046、885～879 cm-1处的7个共有峰之外，白及在1679、1632、1583、1525、1267、1147、1106、928 cm-1处有明显吸收峰；3组“水白及”中B组在1719、1642、1272 cm-1处有明显吸收峰，C组1715、1280、803 cm-1处有明显吸收峰，D组在1717、1652、1417、1270、930、815 cm-1处有明显吸收峰。白及和“水白及”在1800～800 cm-1区的红外指纹图谱除了吸收峰的不同，在吸收峰的峰形和峰强等方面也存在明显区别，所以红外光谱可以作为白及和“水白及”的鉴别依据。

图3 白及(A)和“水白及”(B～D)红外光谱图(4000～525cm-1)

3.2 二阶导红外光谱图分析

二阶导数光谱，可以提高光谱图的分辨率，在一定程度上减少红外光谱重叠峰的叠加，使吸收峰变得窄而尖。采用Origin进行二阶导处理，选用Savitsky-Golay卷曲平滑法进行平滑处理，得到特征峰明显的二阶导数光谱图；在红外光谱图中，1800 cm-1之前会受到-OH的影响，在800 cm-1之后基线的漂移过大，因此选择1800～800 cm-1范围，对白及和“水白及”二阶导数光谱图进行分析[17-18]。

从图4可以看出，在1800～1300 cm-1范围内，白及和“水白及”的二阶导数光谱图在峰数、峰位、峰形、峰强上均存在明显的差异，可以用于鉴定。从图5可以看出，白及和“水白及”的二阶导数光谱图在1300～800 cm-1范围内，区域1中白及在1224、1200、1154 cm-1处峰明显，“水白及”(B)在1240、1197、1154 cm-1处峰明显，“水白及”(C)在1202、1168、1135 cm-1处峰明显，“水白及”(D)在1199、1167、1128 cm-1处峰明显，白及的峰强显高于“水白及”(B、C、D)的峰强；在区域2中白及在998、930 cm-1处峰明显，“水白及”(B)在993、941 cm-1处峰明显，“水白及”(C)在982、935 cm-1处峰明显，“水白及”(D)在1015、983、928 cm-1处峰明显，白及和“水白及”(D)的峰强显高于“水白及”(B、C)的峰强。

图4 白及(A)和“水白及”(B～D)二阶导数红外光谱图(1800～1300cm-1)

图5 白及(A)和“水白及”(B～D)二阶导数红外光谱图(1300～800cm-1)

3.3 系统聚类分析(HCA)

以37白及和“水白及”样品的红外光谱为原始数据，运用SPSS27.0软件，采用组间联接法以平方欧式距离为分类依据进行系统聚类分析，得到聚类分析结果见图6；从图中可知，当欧氏距离为5时，37批样品被分为两类，19批白及聚为一类，18批“水白及”聚为一类。HCA分析结果表明，白及与“水白及”之间存在明显差异。

图6 白及和“水白及”聚类分析图

3.4 主成分分析(PCA)

主成分分析是一种有效的解释复杂数据的工具，通过对复杂数据降维，将数据众多变量的多元变量浓缩成少数主成分，前几个主成分往往能够在复杂的中药体系中表征数据的总体信息，近年来，该方法在中药评价和鉴别方面广泛应用[19-21]。为更加客观的分析白及和“水白及”的差异性，选取红外光谱在 1800～800 cm-1内的数据，采用SIMCA 16.1软件对白及和“水白及”共37个样本进行主成分分析(PCA)，得到主成分分析得分图(见图7)，其中PC1和PC2的方差贡献率分别为96.8%和2.72%，累计方差贡献率达99.52%。模型解释率参数R2X为0.992、预测能力参数为0.99，表征PCA模型的区分度和预测程度都较好。由图7(A)可知，白及和“水白及”样品分别分布在t[1]象限的负值区和正值区；如图7(B)所示，各点的聚集状态充分证明白及和“水白及”内在成分不同。由此可见，PCA对白及和其伪品“水白及”样品具有较好的区分效果。

A

3.5 正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

在无监督PCA分析的基础上，进行OPLS-DA分析(见图8)，白及和“水白及”所处象限范围与PCA分析结果一致，但组间的差异变大、组内的差异变小。由图8可知，白及样品分布在t[1]负值区域，“水白及”样品分布于t[1]正值区域，白及和“水白及”样品可以达到较好的区分效果。模型解释率参数R2X、R2Y分别为0.999、0.992，预测能力参数Q2为0.983，R2、Q2的数值均高于0.5，说明模型稳定性好，预测能力强[22-23]。如图9所示，经过200次置换检验得到R2和Q2的Y轴截距分别为0.203和﹣0.59，说明模型验证有效。

A

图9 白及和“水白及”OPLS-DA模型交叉验证结果

4 讨论

随着白及药材野生资源的枯竭，以及栽培技术的制约，近年来白及药材的用量较大，价格居高不下，使得市场中出现多种混伪品。白及的混伪品主要来源于兰科、百合科多种植物，其切片以后外形和白及较为相似，易与白及饮片造成混淆[7]。该研究运用红外光谱，结合化学计量学分析软件，探讨白及和其伪品“水白及”的快速鉴别方法。

通过红外光谱指纹图谱研究发现，白及和“水白及”在1800～800 cm-1区域内存在明显差异，除7共有峰之外，白及具有8处明显吸收峰，3组“水白及”中B组具有3处有明显吸收峰、C组具有3处有明显吸收峰、D组具有6处有明显吸收峰。从二阶导数光谱图中发现，白及和“水白及”在1800～800 cm-1峰位、峰形及峰强存在明显差异，表明白及与“水白及”化学成分存在差异。

在运用HCA、PCA、OPLS-DA方法后能明显鉴别白及和“水白及”。通过系统聚类分析(HCA)，当欧氏距离为5时，白及和“水白及”聚为两类。PCA和OPLS-DA的分析结果一致，白及分布在t[1]象限负值区，“水白及”分布在t[1]象限正值区，其中OPLS-DA的分类结果最突出。该研究为白及和其伪品“水白及”的鉴别提供了快速、简便的方法，也为白及的鉴别及质量评价提供了科学依据。