基于液相色谱-质谱法技术的脓毒症代谢标志物研究①

黄荔丰,黄双莲,蔡志仕,徐文鑫,黄仲庆,张春斌

(1 漳州卫生职业学院,福建 漳州 363000;2 福建省漳州市医院急诊科,福建 漳州 363000)

脓毒症发生率高,而且由于早期无特殊症状,在临床上很容易漏诊以及误诊,并且病死率高,医疗花费高,严重威胁人类生命健康,降低患者生存质量[1]。目前几乎没有生物标志物可以准确诊断早期脓毒症以及预测患者的预后情况。随着系统生物学检测技术的发展,利用小分子代谢产物等对早期脓毒症患者风险和预后进行评估得到越来越多的研究。本研究应用LC/MS技术的正离子模式对成人早期脓毒症患者和健康成人的外周血进行监测,运用PCA、OPLS-DA、单变量统计分析等多种统计方法对两者代谢物质进行统计学处理,找出差异,探索寻找早期脓毒症患者潜在的血清代谢标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019-03～2021-02漳州市医院急诊科及急诊病房收治的脓毒症20例患者作为脓毒症组,同期健康体检者20例为对照组。纳入标准:(1)符合《国家严重脓毒症和脓毒症休克治疗指南(2012)》;(2)发病年龄>18岁;(3)临床及实验室资料完整。排除标准:(1)合并严重肝肾疾病;(2)合并恶性肿瘤、血液系统疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病;(3)长期接受激素或免疫抑制剂治疗。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

Waters公司ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1mm× 100mm, 1.7μm)色谱柱,Thermo Fisher Scientific公司Vanquish超高液相色谱仪。

1.2.2 血样采集

所有研究对象均于清晨采集隔夜空腹外周血,采集的血样置于无抗凝剂的真空采血管中,2500rpm离心10min后取上清液置于新EP管中,-80℃冰箱中保存备用。

1.2.3 血清代谢物检测

取样本50μL于1.5mL EP管中,加入200μL提取液(甲醇:乙腈=1:1,含同位素标记内标混合物),涡旋混匀30s, 超声10min(冰水浴);将样品4℃,12000rpm离心15min,取上清于进样瓶中上机检测,所有样品另取等量上清混合成QC样品上机检测。

1.2.4 数据处理和分析

原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后,使用R程序包(内核为XCMS)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理,然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释,算法打分的Cutoff值设为0.3,再通过 R(v3.3.2)XCMS 程序分析获得质核比(mass to charge ratio, m/z)、保留时间(retention time,rt)、峰面积(intensity)等信息的数据矩阵;同时进行峰面积的批次归一化和标准化处理。使用SIMCA软件(V16.0.2),对数据进行对数转换加中心化格式化处理,然后进行自动建模分析[2]。

1.3 统计学方法

采用PCA、OPLS-DA对各组数据进行归类,去除重复性差的样本和异常样本,并得到变量投影重要度(variable importance in the projection, VIP) 值。采用t检验得到P值,并且根据P值和VIP值筛选出具有统计学意义的差异代谢物。通过HMDB、Metlin等数据库进行匹配注释获取差异代谢物准确信息,进行代谢物结构鉴定。经层次聚类(hierarchical clustering)分析形成热图,观察两组之间的差异代谢产物分类情况。通过ROC曲线进一步评价并筛选潜在的生物标记物。采用 KEGG 数据库对差异性代谢物进行通路富集分析(P<0.05 为差异有统计学意义)。所有统计分析和绘图均采用 R 软件进行。

2 结果

2.1 临床特征

本研究共纳入40例标本,脓毒症组20例,对照组20例。脓毒症组男12例,女8例,平均(60.05±17.87)岁。对照组男15例,女5例,平均(51.15±11.51)岁。两组年龄及性别等资料无统计学差异(P>0.05),见表1。

表1 脓毒症组和对照组基本资料对比(n=20)

2.2 多元统计分析结果

PCA分析结果显示,脓毒症组与对照组分布在不同的区域(图1A),表明病变后血清代谢物组成发生较大差异。进一步构建正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),得到相应的散点分布图(图1B),由图可知,各样品组内有很好的聚集性,而两组之间又有很强的分离性。

图1 两组血清代谢组学PCA(A)及OPLS-DA分散点图

2.3 差异代谢物的筛选

基于OPLS-DA模型,以VIP>1,P<0.05为筛选标准,并利用HMDB、Metlin等数据库进行验证,最终得到差异代谢物135个。为了更直观表示这些化合物含量的变化,采用热图进行表示(图2),从结果可以看出病变组血清代谢物发生了较大改变。计算135个差异代谢物在两组实验间的倍数关系(Fold change)值,设定Fold change>5.00或<0.2,找到 17个重要差异代谢物(表 2),并且鉴定出 4个内源性代谢物:5’-甲硫腺苷,异亮氨酸丙氨酸,泼尼松龙和甾体。

图2 脓毒症组对健康组的层次聚类分析热力图

表2 脓毒症组与健康组血样中的重要差异代谢物鉴定结果

2.4 代谢通路分析

经 KEGG 数据库对脓毒症患者差异性代谢物的代谢通路进行分析。结果显示两组主要差异性代谢物富集于7条代谢途径:嘧啶代谢,精氨酸和脯氨酸代谢、氮代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢,亚油酸代谢、硫代谢、色氨酸代谢(图3)。根据代谢通路的P值及影响力值,嘧啶代谢可能是代谢物差异相关性最高的关键通路(P=0.0052)。

图3 代谢通路分析结果

3 讨论

脓毒症患者机体以代谢亢进、高分解代谢状态及静息能量消耗增加为主要的代谢特点[3],三大营养物质(糖、蛋白质和脂肪)及其代谢产物比例发生显著变化。而通过研究脓毒症患者早期代谢产物的改变,有助于早期诊断脓毒症。而代谢组学的出现为研究脓毒症患者整体代谢谱的变化提供了新的契机[4]。本次研究通过运用LC-MS联用技术测定成人脓毒症患者与健康人员代谢产物,通过PCA分析和O-PLS-DA分析可见两组样本代谢产物差异显,而且处于95%置信区间,提示两组样本的代谢产物具有显著差异性。将代谢物质经二级质谱定性匹配分析及ROC曲线分析,最终鉴定出 4个内源性代谢物:5’-甲硫腺苷、异亮氨酸丙氨酸、泼尼松龙和甾体。

5甲基硫腺苷(5'-Methylthioadenosine MTA)是一种天然存在的含硫核苷,存在于所有哺乳动物组织中。MTA作为一种代谢物,可以转化为蛋氨酸,在血浆中的含量为11mmol/L[5～7]。MTA主要通过多胺生物合成途径由S腺苷甲硫氨酸产生抑制产物。该化合物仅由MTA磷酸化酶代谢,产生5甲基硫代核糖1磷酸和腺嘌呤,分别是蛋氨酸和嘌呤补救途径中的关键步骤。MTA已被证明可以影响许多细胞的关键反应包括基因表达、增殖、分化和凋亡的调节。MTA可以增强沙门氏菌感染后的细胞死亡,这归因于其作为蛋氨酸前体的作用[6]。MTA 还具有甲基转移酶抑制剂作用[8,9],可以在干扰素反应过程中抑制 Stat1甲基化[10]。MTA在LPS刺激后具有可以阻断TNF-a的产生[7,10,11]。Peter A Keyel[12]的研究表明MTA 通过腺苷受体重新编程TLR激活途径以促进炎症的消退。所有这些都显示MTA与炎症介质生成相关的信号通路[13]相关。郑浩等研究报告也显示甲硫腺苷与新生儿脓毒症具有相关性[14]。本次研究中发现5’-甲硫腺苷(MTA)在两组之间有显著差异,脓毒症患者明显升高,与上述研究相符。

脓毒症时蛋白质分解增加,其中支链氨基酸利用率增加,同时精氨酸的利用率下降,机体对芳香族氨基酸的清除率下降,导致血液中精氨酸及芳香族氨基酸增加,支链氨基酸下降。本次研究中早期脓毒症患者异亮氨酸丙氨酸升高,与上述理论不符合,考虑可能是标本量少,存在误差。

泼尼松龙片属于糖皮质激素的药物,能够对抗细菌内毒素对机体的刺激反应,减轻细胞损伤,保护机体。甾体是具有环戊烷多氢菲的基本骨架结构的一类天然化学成分,广泛存在于自然界中。对于这两种物质与脓毒症的相关性,国内外研究甚少,仍需进一步验证。

综上所述,LC-MS联用技术可以用于脓毒症患者代谢谱的研究,MTA等4种代谢物在脓毒症患者有显著差异,而MTA有成为早期诊断脓毒症血清标志物的可能性。今后仍需对差异的代谢产物进一步研究,并深入阐述其生物学意义。本次研究不足之处病例少,多数脓毒症患者年龄较大,且可能合并多种疾病,可能造成结果偏差较大,仍需增加样本量进一步研究;并且由于经费所限,仅做了正离子检测,未做负离子检测,亦可能影响结果。