黏质沙雷氏菌H04的有机磷降解活性及促生能力

李 翯, 王鹏宇, 陈子轩, 王柳楠, 徐晨琪, 任 虹

(北京工商大学轻工科学技术学院/北京工商大学中国轻工业清洁生产和资源综合利用重点实验室,北京 100048)

利用解磷菌作为微生物菌剂是一种低成本、生态安全、可持续的具有环境效益和经济效益的替代策略[6]。解磷菌可通过产酸或酶解将难溶性有机磷和无机磷转化成有效磷,从而直接或间接促进植物生长[7-9]。解磷菌多来自植物的根际处,主要属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)和不动杆菌属(Acinetobacter)[10-11]。其中,黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)是一类革兰氏阴性菌株,许多研究表明黏质沙雷氏菌可通过诱导磷酸盐的溶解、几丁质酶和蛋白酶的分泌以及铁载体的产生来促进植物生长[12-14]。Farhat等报道,黏质沙雷氏菌能溶解难溶性无机磷,包括磷矿、磷酸三钙和羟基磷灰石[15]。George等从椰子树根际分离得到的黏质沙雷氏菌KiSⅡ具有良好的解磷能力,其分解磷酸三钙最高可释放 216 μg/mL 的有效磷,并显著促进水稻生长[16]。然而,目前关于黏质沙雷氏菌对有机磷源的利用和相应解磷机制的研究较少。

本研究以来自北京工商大学的槐树根际土壤的黏质沙雷氏菌H04为研究对象,定性、定量评价其对有机磷源(卵磷脂、植酸)的利用能力,探讨其解磷机制,并初步探究H04对轮作农作物绿豆和小麦种子早期生长的影响,以期为农作物微生物菌剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 试验于2021年6—10月在中国轻工业清洁生产和资源综合利用重点实验室完成。黏质沙雷氏菌H04,笔者所在课题组从北京工商大学(116°19′26″E,39°55′24″N)槐树根际处筛选得到。磷酸酶、植酸酶活性和绿豆小麦发芽试验中阳性对照菌株:绿针假单胞菌产金色亚种。

1.1.2 培养基 有机磷固体培养基:葡萄糖 10.0 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·H2O 0.03 g,卵磷脂 0.2 g(或植酸钙 2.0 g),酵母浸粉 0.5 g,琼脂 18.0 g,去离子水1 000 mL。

有机磷液体培养基:葡萄糖 10.0 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·H2O 0.03 g,卵磷脂 0.2 g(或植酸钙 2.0 g),酵母浸粉 0.5 g,去离子水1 000 mL。

NB培养基:牛肉膏 5.0 g,蛋白胨 10.0 g,氯化钠 5 g,去离子水1 000 mL。

1.2 解磷能力的评价

1.2.1 定性评价 解磷能力的定性评价应用点培养法[17]。使用灭菌的牙签,将菌株H04分别点接种于以卵磷脂或植酸钙为唯一磷源的有机磷固体培养基平板上,每个平板接种3个点,3组平行试验,置于30 ℃恒温培养10 d,观察有无透明圈的产生,并每天测量透明圈直径(含菌落)与菌落直径,计算解磷指数,解磷指数=A/B,其中A是包括菌落在内的透明圈直径,B是菌落直径。解磷指数大于1表明菌株在平板上有解磷活性。

1.2.2 定量评价 解磷能力的定量评价应用钼锑抗比色法[18]。菌株H04在NB培养基中以 180 r/min、30 ℃培养过夜,调整D600 nm为0.6。NB培养液接种到以卵磷脂或植酸钙为唯一磷源的有机磷液体培养基中,180 r/min、30 ℃培养。定期取10 mL培养液用钼锑抗比色法测定其可溶磷的含量。用pH计测定培养基的pH值。

1.3 解磷机制的初步研究

1.3.1 种子液的配制 菌株H04在NB培养基中180 r/min、30 ℃培养过夜,调整D600 nm为0.6。

1.3.2 磷酸酶活性测定 将菌株H04以2%的接种量接种于以卵磷脂为唯一磷源的有机磷液体培养基中,180 r/min、30 ℃培养4 d。用酸性磷酸酶和碱性磷酸酶试剂盒检测酶活性。以37 ℃中1 mL液体1 min水解1 μmol对硝基苯磷酸二钠产生对硝基苯酚定义为一个酶活单位。所有测量进行3组重复,以未接种的培养基作为阴性对照,以已被报道具有植物生长促进活性和抗菌活性的微生物绿针假单胞菌产金色亚种作为阳性对照(CK+)[19]。

1.3.3 植酸酶活性测定 将菌株H04以2%的接种量接种于以植酸钙为唯一磷源的有机磷液体培养基中,180 r/min、30 ℃培养4 d。以GB/T 18634—2009《饲用植酸酶活性的测定 分光光度法》为标准,采用分光光度法测定菌株H04的植酸酶活性[20]。在37 ℃、pH值5.5条件下,每分钟从5.0 mmol/L植酸钠溶液中释放1 μmol无机磷,即为一个植酸酶活性单位。用下列公式计算植酸酶活性:

植酸酶活性(U/mL)=(y×n)/(m×t)。

式中:y代表无机磷含量,μmol;m代表样品体积,mL;t代表酶解反应时间,min;n代表样品稀释倍数;所有测量均重复3次,以未接种的培养基作为阴性对照。绿针假单胞菌产金色亚种作为阳性对照(CK+)。

1.4 H04对绿豆和小麦早期生长的影响

为制备接种物,将菌株置于NB培养基中 30 ℃、180 r/min下培养8 h。接种前,绿豆和小麦种子表面用0.1% NaClO灭菌5 min,无菌去离子水洗涤3次。以每30粒种子15 mL的比例,将细菌悬浮液作为种子浸液施用3 h后风干。然后将每30粒风干种子转移到放有无菌滤纸的培养皿中,设置3组平行。培养皿中,种子在黑暗下培养48 h,然后在室温下以昼夜为周期进行培养。按照要求用无菌去离子水浇水。以无菌去离子水浸种的种子为阴性对照(CK-),绿针假单胞菌产金色亚种为阳性对照(CK+)。

培养3 d,统计绿豆和小麦种子发芽数。7 d时,测定绿豆幼苗的根长、根粗、鲜质量、干质量和根系活力,同时测定小麦幼苗的出苗率、根长、芽长、鲜质量、干质量和总叶绿素含量。

应用TTC法计算根系活力[21],并用TTC还原强度来表示:

TTC还原强度[μg/(g·h)]=TTC还原质量(μg)/根鲜质量(g)×时间(h)。

应用研磨提取法,并用80%丙酮提取总叶绿素[22],按公式计算叶绿素含量:

叶绿素a含量(mg/g)=(12.7D663 nm-2.59D645 nm)×提取液体积(mL)/1 000×样品质量(g);

叶绿素b含量(mg/g)=(22.9D645 nm-4.67D663 nm)×提取液体积(mL)/1000×样品质量(g)。

总叶绿素含量(mg/g)=叶绿素a含量(mg/g)+叶绿素b含量(mg/g)。

1.5 统计分析

所有统计分析均采用SPSS 25.0进行。通过方差分析和皮尔逊相关性分析对数据进行分析。为了检测均值之间差异的统计学意义(α=0.05),进行了邓肯多重范围检验。

2 结果与分析

2.1 解磷能力评价

定性试验发现,菌株H04在分别含有卵磷脂、植酸钙为唯一磷源的有机磷固体培养基中均能产生明显的透明圈(图1),解磷指数分别为1.94和5.89。

定量试验发现,当磷源为卵磷脂时,可溶性磷含量在1 d时显著下降,之后逐渐上升,发酵4 d后达到最大值(2.89±0.12)mg/L,如图2-A所示。与初始pH值相比, pH值在1 d时降至最低5.02,2 d 时升至7.93,随后一直稳定在碱性(pH值7.93～8.36),随着pH值的增加,可溶性磷含量逐渐增多,但两者相关性不显著。

如图2-B所示,当磷源为植酸钙时,可溶性磷含量逐渐升高,在2 d达到(20.26±1.04)mg/L,并维持至7 d达到峰值(22.99±0.45)mg/L。pH值由0 d时的5.75降至1 d时的2.75,2 d至7 d时维持在2.45～2.90之间。可溶性磷含量与pH值呈负相关关系(P<0.05)。

2.2 解磷机制的研究

2.2.1 磷酸酶活性 为了进一步探讨可溶性磷含量的增加与相关酶活性的关系, 对菌株H04的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性进行检测。结果如图 3-A 和图3-B所示,与CK+相比,菌株H04的酸性磷酸酶活性较低,而碱性磷酸酶活性明显高于阳性对照CK+。菌株H04的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性在3 d同时达到最大值,分别为(17.07±0.14)U/L和(35.20±0.46)U/L。

2.2.2 植酸酶活性 H04的植酸酶活性结果如图3-C所示。菌株H04的植酸酶活性在3 d时达到最大值,为(1 417.01±48.38)U/L,与CK+相比,菌株H04具有更高的植酸酶活性。

2.3 H04对绿豆和小麦种子早期生长的影响

2.3.1 对绿豆生长的影响 菌株H04对绿豆发芽率和幼苗生长的影响如表1和图4所示。与阴性对照(CK-)相比,菌株H04处理增加了绿豆的萌发,发芽率显著增加了11%,而绿豆幼苗的鲜质量、根长、根粗和根系活力也显著提高,分别增加了25%、162%、35%和212%。菌株H04对绿豆生长的影响效果大于阳性对照(CK+),尤其,根长和根系活力效果显著,分别提高了135%和132%。

表1 H04对绿豆发芽率和早期生长的影响

2.3.2 对小麦生长的影响 菌株H04对小麦发芽率和幼苗生长的影响如表2所示。与CK-相比,接种H04可显著促进小麦种子的萌发, 分别显著提高发芽率12%和出苗率17%,而生物量和总叶绿素含量方面无显著差异。菌株H04对小麦早期生长的促进作用明显优于CK+。

表2 H04对小麦发芽率、出苗率和早期生长的影响

3 讨论

本研究对黏质沙雷氏菌H04的解有机磷(卵磷脂和植酸钙)能力进行定性和定量测定,初步探究其解磷机制,并初步研究其对轮作作物绿豆和小麦的早期生长的影响,为后续研究和促生应用提供理论基础和技术支持。

通过有机磷固体培养基上形成解磷透明圈,作为定性评价细菌解磷能力的依据,是一种有用但非决定性的方法。因此,有必要结合解磷菌在液体培养中的定量试验来评价其解磷能力[23]。解磷能力的定性和定量试验的结果表明,H04表现出了降解卵磷脂和植酸钙的能力,解磷指数分别为1.94和5.89,可溶性磷含量最高分别为(2.89±0.12)mg/L和(22.99±0.45)mg/L。

解磷菌对有机磷的矿化作用主要与酶解作用有关[24]。在以植酸钙为唯一磷源的发酵试验中,H04通过分泌植酸酶降解植酸钙,并且当培养至3 d时,酶活最高可达(1 417.01±48.38)U/L(图3-C)。Tang等曾报道黏质沙雷氏菌 SM01能分泌植酸酶(500 U/L)[25],与笔者所在课题组的结果相符。另外,试验中还发现,H04通过分泌植酸酶来增溶植酸钙时,培养液的pH值始终维持在2.81～2.88,表明酸性条件有利于黏质沙雷氏菌H04分泌植酸酶,提高植酸酶活性,促进植酸钙降解。

到目前为止,黏质沙雷氏菌对卵磷脂解磷机制的研究尚未见报道。在以卵磷脂为唯一磷源的发酵试验中,可溶性磷含量在前3 d呈较低的水平,而酸性磷酸酶和碱性磷酸酶在这期间逐渐升至最高,分别为(17.07±0.14)U/L和(35.20±0.46)U/L,其中,酸性磷酸酶活性低于CK+,而碱性磷酸酶活性明显高于CK+(图3-A、图3-B)。这可能是由于低磷水平下,促使H04分泌磷酸酶,磷酸酶的活性升高,促进难溶卵磷脂的分解。此外,H04溶解卵磷脂时,酸性磷酸酶活性较低,在4.57～17.07 U/L之间,而碱性磷酸酶活始终高于酸性磷酸酶,碱性磷酸酶活性在17.47～35.20 U/L之间。这可能是由于培养液的pH值呈碱性(7.93～8.36)更利于碱性磷酸酶发挥作用。首次发现黏质沙雷氏菌 H04对卵磷脂的利用与酸性磷酸酶和碱性磷酸酶有关,并主要分泌碱性磷酸酶来降解卵磷脂。

以黏质沙雷氏菌作为微生物菌剂对于单一作物的促生能力已经有所报道。例如Breitkreuz等[26]研究发现黏质沙雷氏菌(UFV-E13)对番茄的影响,并能提高番茄株高,控制黑斑病。Hameeda等报道,从堆肥中分离出的黏质沙雷氏菌EB67,可提高玉米的生物量(干质量)和玉米籽粒产量[27]。但是目前已报道的黏质沙雷氏菌促生能力研究多集中于种植单一作物,然而农业生产往往以轮作的形式进行,在农业生产中,经常选择豆科植物和禾本科作物轮作增产,这对于减少农业生产对化学磷肥和农药的依赖、保护农田生物多样性以及提高资源利用效率具有重要意义[28-29]。此外,豆科植物还可以通过改变根际土壤磷的含量,促进相邻禾本科作物对磷的吸收,从而提高磷的利用率[30]。因此,笔者所在课题组进行了H04对豆科作物(绿豆)和禾本科作物(小麦)的种子萌发和早期生长的影响试验,将H04分别接种于绿豆和小麦种子,结果表明,H04对绿豆和小麦的生长有积极的影响,如表1、表2、图4所示。接种H04可提高绿豆幼苗的发芽率、鲜质量、根长、根粗和根系活力,还可增强小麦的发芽率和出苗率,特别对绿豆的根长和根系活力,可分别显著增长135%和132%。H04能更好地促进这2种作物的种子萌发和生长发育。因此,黏质沙雷氏菌H04对于2种轮作农作物(豆科作物绿豆与禾本科作物小麦)种子发育生长起到有益影响,有望成为改善农作物生长的生物可持续替代品。

4 结论

黏质沙雷氏菌H04在有机磷固体和液体培养基中均表现出良好的利用卵磷脂和植酸钙的能力。黏质沙雷氏菌 H04通过分泌碱性磷酸酶来分解卵磷脂、分泌植酸酶来分解植酸钙。对绿豆和小麦的早期生长试验表明,黏质沙雷氏菌 H04能提高二者的发芽率和根系生长,特别是对绿豆的促进作用十分显著。本研究首次报道了黏质沙雷氏菌对于卵磷脂的利用与酸性磷酸酶和碱性磷酸酶有关,并且主要分泌碱性磷酸酶来降解。总体结果表明,H04可以作为植物促生菌剂的潜在候选,在农业生态系统中,特别是豆科作物和禾本科作物轮作系统中表现出巨大的潜力,进一步的开发利用将证实这种潜力及其未来的商业应用。