基于AQP8、NHE3、CFTR探究参苓白术散对腹泻幼鼠模型肠黏膜的保护作用及机制

王彦彬，王晓颖，徐国娟，戚敏敏，梁翠才，马玮玮

（河西学院，甘肃 张掖 734000）

腹泻的临床发病率较高，是由于多种原因造成的水、电解质转运失常，常表现为大便次数增多、大便性状变化，多发生于6 个月～2 岁的儿童群体中[1]。水通道蛋白( aquaporins，AQPs) 是肠上皮细胞膜上负责跨细胞转运水分子的主要蛋白[2]。跨膜转运蛋白钠氢交换体（Na+/H+ exchangers，NHEs）是肠道对Na+的吸收蛋白，可促进肠道对Na+的吸收，进而形成浓度梯度。Cl-的肠道吸收和分泌与囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）通道有关[3]。研究[4]发现，腹泻时，肠道黏膜中AQPs、NHEs、CFTR 会出现异常表达，使肠道黏膜对H2O、Na+、Cl-的通透性增加，致使水、电解质在肠道内大量聚集。参苓白术散属于常用的经典中药方剂，目前广泛用于小儿腹泻的治疗，多数患儿可从中获益。但对于参苓白术散是否可通过影响肠黏膜AQPs、NHEs 和CFTR 的表达来治疗腹泻，目前尚未见报道[5]。本实验通过检测腹泻幼鼠模型结肠黏膜AQP8、NHE3 和CFTR 的表达情况，探讨参苓白术散的止泻作用机制，旨在为参苓白术散治疗小儿腹泻提供现代医学理论证据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

购置雄性SD 幼鼠50 只，随机取10 只设为正常组。其余40 只SD 幼鼠于每日上午予番泻叶药液灌胃，连续干预14 d，建立幼鼠腹泻模型；建模成功后分为模型组、参苓白术散低、中、高剂量组，每组10 只。50 只SPF 级雄性SD 幼鼠的体重为80 ～100 g，平均（90.00±10.00）g。所有幼鼠均购自甘肃兰州兽研所。所有幼鼠均进行1 周的适应性喂养，控制室温在24 ～26℃，自由进食饮水，适应性饲养1 周后开始实验。

1.2 仪器与设备

（1）药物及试剂：参苓白术散（购于北京德寿堂医药有限公司，人参15 g、茯苓15 g、白术15 g、白扁豆12 g、山药12 g、莲子9 g、砂仁6 g、炙甘草9 g）；番泻叶（购于吉林省松辽制药有限公司）；AQP8、NHE3、CFTR 一抗（购于北京博奥森生物科技有限公司）；苏木素- 伊红（HE）染色液（购于南京建成生物工程研究所）。番泻叶水煎剂的制备：精确称取番泻叶400 g 浸泡于2000 mL 纯净水中，搅拌均匀后静置30 min；用武火煮沸10 min，使其浓缩至1200 mL，用4 层纱布进行过滤后即完成番泻叶药液的制备，药物浓度最终为0.3 g/mL，置于4℃冰箱中备用。（2）实验仪器：高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、半干转膜仪系统、切片机。

1.3 方法

（1）动物分组。将50 只SPF 级雄性SD 幼鼠（体重80 ～100 g）分为正常组、模型组、参苓白术散低、中、高剂量组，每组10 只。除正常组外，其余各组用番泻叶药液灌胃，根据参考文献[6]确定番泻叶药液的浓度为0.3 g/mL。按10 mL/kg 灌胃，每日1 次，连续干预14 d，建立幼鼠腹泻模型。正常组予等量蒸馏水灌胃。（2）给药方法。为参苓白术散低、中、高剂量组使用参苓白术散药液灌胃，给药体积均为10 mL/kg ；低剂量组的给药剂量为1.2 g/kg，中剂量组的给药剂量为2.3 g/kg ；高剂量组的给药剂量为4.6 g/kg。正常组、模型组予等量蒸馏水灌胃。各组均连续灌胃14 d。每3 天完成1 次体重称量，并动态调整药物剂量。同时，给药过程中观察幼鼠情况，并完成粪便的收集。（3）标本采集。对各组幼鼠进行灌胃后，以3.5% 水合氯醛（10 mL/kg）完成麻醉，取远端结肠组织，常规清洗，一部分置于福尔马林液中浸泡，一部分置于-80℃冰箱中冻存。

1.4 观察指标

（1）幼鼠表征观察。每日观察并记录幼鼠的皮毛色泽、活动状态和粪便性状；称量幼鼠的体重，计算其腹泻指数。（2）HE 染色情况。取各组幼鼠的结肠组织，经石蜡组织固定后完成切片的制备，并进行常规的HE 染色，于光镜下观察结肠的病理改变情况[7]。（3）结肠黏膜的AQP8、NHE3 和CFTR 表达。用免疫组织化学法检测各组结肠黏膜AQP8、NHE3和CFTR 的表达情况。用Western blot 法检测各组结肠黏膜中AQP8、NHE3 和CFTR 的含量[8]。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数± 标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组幼鼠的一般情况

2.1.1 幼鼠表征观察 正常组幼鼠行动灵活，精神状态良好，饮食正常，毛发浓密有光泽，大便正常。与正常组比较，模型组幼鼠行动迟缓，精神萎靡不振，毛发稀疏，伴有毛发脱落，肛门红肿、周围体毛有少量稀便沾染。与模型组相比，参苓白术散低、中、高组幼鼠的行动灵活性、精神状态、毛发光泽度等情况均得到不同程度的改善。见图1。

图1 各组幼鼠表征

2.1.2 各组幼鼠体重、腹泻指数的比较 正常组幼鼠体重增长迅速，模型组幼鼠体重增长缓慢，且差异明显（P＜0.05）。参苓白术散各组体重均有明显的增长；参苓白术散组的腹泻指数低于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组幼鼠体重、腹泻指数的比较（± s）

表1 各组幼鼠体重、腹泻指数的比较（± s）

注：a 与正常组比较，P ＜0.05 ；b 与模型组比较，P ＜0.05。

组别 只数 体重（g）腹泻指数造模前 干预后 造模前 干预后参苓白术散组低剂量组 10 102.98±9.52 138.41±15.67ab 0.00±0.00 0.63±0.14ab中剂量组 10 103.11±9.56 140.39±15.69ab 0.00±0.00 0.65±0.16ab高剂量组 10 103.03±9.53 139.63±15.68ab 0.00±0.00 0.64±0.15ab模型组 10 103.52±9.56 114.39±12.31a 0.00±0.00 0.85±0.14a正常组 10 102.99±9.51 142.98±16.72 0.00±0.00 0.00±0.00

2.1.3 各组幼鼠粪便的变化情况 除正常组外，其他组幼鼠在予番泻叶药液灌胃3 天后均出现粪便呈湿软质黏状态、附着于滤纸上的情况。5 天后粪便成为夹杂黏液的水样稀便，且排便次数增加。正常组的粪便为质硬椭圆形粪便。与正常组相比，其他组幼鼠的粪便含水量和腹泻指数均明显更高。参苓白术散各剂量组给予相应药物干预3 天后，粪便基本成形，质地湿软。5 天后粪便皆为成形便，含水量明显下降，但是与正常组的粪便相比，还是偏松软。见图2。

图2 参苓白术散各剂量组幼鼠的大便性状

2.2 各组幼鼠结肠黏膜的形态学变化

与正常组比较，模型组幼鼠的结肠黏膜表皮细胞坏死明显，且其结肠黏膜伴有毛细血管的扩张，存在少许中性粒细胞的浸润；与模型组比较，参苓白术散各剂量组幼鼠的结肠黏膜表皮细胞凋亡坏死、固有层毛细血管扩张充血和中性粒细胞浸润现象明显改善。见图3。

图3 各组幼鼠结肠黏膜的形态学变化

2.3 免疫组化法检测AQP8、NHE3 和CFTR 的表达情况

与正常组比较，模型组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3 的表达下降，CFTR 的表达升高。与模型组比较，参苓白术散各剂量组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3的表达明显升高，而CFTR 的表达明显下降。见图4。

图4 免疫组化法检测AQP8、NHE3 和CFTR 的表达情况

2.4 Westernblot 法检测AQP8、NHE3 和CFTR的含量

与正常组比较，模型组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3 的含量减少，CFTR 的含量增加。与模型组比较，参苓白术散各剂量组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3的含量明显增加，而CFTR 的含量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图5。

图5 各组幼鼠结肠黏膜中AQP8、NHE3 和CFTR 含量的比较

3 讨论

发生腹泻时，常会并发脱水、电解质及酸碱平衡紊乱。结肠是肠道中吸收水和电解质的主要场所，AQPs 的作用主要是调节胃肠道内的水液代谢，维持机体内水液含量的相对稳定[9]。哺乳类动物的已知AQPs 有13 种。在其胃肠道中，至少存在11 种AQPs。其中AQP1、AQP3、AQP8 在结肠中的表达水平较高，其表达水平能直接影响消化道疾病的发生和发展[10]。既往研究表明，AQP1、AQP3、AQP8 的表达水平与结肠的水液代谢有关。NHEs 共有9 个亚型。其能参与上皮细胞盐的运输，从而影响细胞中pH值、细胞体积。NHEs 是一种跨膜转运蛋白，其生理作用是使Na+转运到细胞外的同时使H+转运到细胞内。其是肠道对Na+的吸收蛋白，可促进肠道对Na+的吸收，进而形成浓度梯度。Na+是维持组织液、血浆渗透压、肠黏膜内外水电解质平衡的关键因素[11]。肠道对电解质的吸收，主要是建立在对Na+吸收的基础上。CFTR 是ATP 结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette，ABC）超家族中的一种，其作用机制的关键是为氯离子跨上皮运动提供了选择性通道[12]。在本实验中，我们发现与正常组相比，模型组幼鼠结肠黏膜AQP8 和NHE3 的表达水平显著降低，而CFTR 的表达水平显著升高，说明腹泻可能与AQP8 和NHE3的表达水平降低、CFTR 的表达水平升高有关。与模型组比较，参苓白术散各剂量组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3 的含量明显增加，而CFTR 的含量明显减少，说明参苓白术散可能是通过上调AQP8 和NHE3 的表达水平、下调CFTR 的表达水平来起到止泻的作用。

综上所述，参苓白术散可通过调节幼鼠肠黏膜AQP8、NHE3、CFTR 的表达水平来促进其体内的水液代谢，并能减轻结肠黏膜受损，起到止泻的作用。