生长素在蔗糖调节山定子幼苗根系亚低温响应和蔗糖代谢中的作用

李丽杰，王 鹏，杨蓓蕾，秦嗣军，吕德国

（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110161）

低温胁迫是一种危害植物正常生长和发育的非生物胁迫，严重威胁着全球的农业生产[1]。苹果根系生长最适宜土壤温度约为15～24 ℃，当土温在3～4 ℃时新根开始生长[2]。当土温为5 ℃时，根系处于亚低温胁迫会导致其氧化还原状态、相关基因的表达、渗透物质代谢以及生长状态等多方面的改变[3-5]。

蔗糖是植物光合作用过程中的产物，不仅参与植株的生长发育，调控种子萌发[6]、根系生长、花器官发育[7]、果实成熟[8]等过程，还参与植物对逆境胁迫的响应。大多数越冬植物中蔗糖积累是前期储备的淀粉被降解为可溶性碳水化合物，以此提高了其耐寒性[9]。蔗糖代谢依赖酶的催化作用，参与蔗糖代谢的酶可分为两种类型，一类为蔗糖的合成酶包括蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS），另一类是蔗糖的水解酶，分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）[10]。孙世君等[11]研究表明根区低温使黄瓜幼苗中SPS和SS活性下降，蔗糖、果糖和淀粉含量减少。在低温胁迫下，多年生黑麦草(Lolium perenneL.)中果糖、葡萄糖和蔗糖含量显著下降后升高，AI先升高后降低，SS和SPS活性逐渐增加，说明蔗糖含量与AI呈负相关，与SPS、SS呈显著正相关[12]。外源蔗糖有利于提高植物中脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量，这一结果已经在许多植物中得到证实，如拟南芥[13]、黄瓜[14]、垂丝海棠[15]等。在低温胁迫下，外源蔗糖处理提高了黄瓜叶片中AI和NI活性，诱导可溶性总糖和内源蔗糖含量增加，有利于黄瓜耐寒性的增强[16]。

小分子的可溶性糖（葡萄糖，果糖，蔗糖）也可以作为信号，它们被认为是关键性整合调节分子，参与了植物的生长发育和胁迫响应[17-18]。有研究表明，蔗糖在调节植物IAA 水平中发挥着重要作用，蔗糖对IAA 水平的影响在根部比在芽中更为明显，也可能影响植物IAA 的合成和运输途径，蔗糖诱导拟南芥幼苗IAA 向根系运输，使根中具有较高的IAA水平，促进拟南芥根系生长；而添加IAA抑制剂会抑制植物IAA的运输，完全阻止了蔗糖诱导的下胚轴伸长[19]。发育中的玉米种子可能通过响应糖浓度而改变生长素的生物合成进而调节生长[20]。虽然已经有一些关于非生物胁迫下外源蔗糖或IAA 对植物渗透调节系统等方面影响的报道，而且蔗糖可以调节植物根系内源IAA含量，但内源IAA是否参与蔗糖调节低温胁迫下植物根系蔗糖代谢尚不明确。

我国冷凉苹果产区，早春气温回升快，而土温回升相对滞后，这就导致当苹果地上部已进入萌芽阶段时其根系仍处于亚低温条件下，进而显著影响果树根系功能和地上部的生长发育进程。山定子（Malus baccataBorkh.）因其具有较强的抗寒性而被广泛应用于我国北方苹果产区，但当其根系在生长期遭受亚低温（5 ℃）时，根系生理功能发生紊乱，地上部生长受到抑制，叶片变小[4]。本课题组前期研究发现外源蔗糖处理能够缓解根区亚低温引起的根系氧化损伤，增加亚低温下山定子根系内源IAA 水平。为研究内源IAA 在外源蔗糖调节山定子根系响应亚低温中的生理作用，本试验以当年生山定子幼苗为试材，设置对照（CK），根区亚低温（L），根区亚低温+蔗糖（L+S）处理和根区亚低温+蔗糖+IAA合成抑制剂（L+S+BBo）处理，通过测定内源IAA含量、渗透调节物质含量、淀粉含量、根系活力、蔗糖代谢相关酶活性等指标，探讨根系内源IAA在蔗糖调控山定子根系响应亚低温中的生理作用，以期为苹果根系低温适应性研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于沈阳农业大学果树栽培与生理生态团队科研基地进行，以当年生山定子（Malus baccataBorkh.）为试材。将采集好的种子经层积催芽后，播于穴盘中，待幼苗长至5片真叶后，转移到含有河沙、园土和育苗基质（1∶2∶1）的营养钵（13 cm×12 cm）中栽植，并进行常规管理。供试蔗糖为国药集团化学试剂有限公司生产；供试IAA合成抑制剂（4-联苯基硼酸）为江苏艾康生物医药研发有限公司生产。

1.2 方法

山定子幼苗长至15 片时，选用长势一致、无病虫害的健壮幼苗，将其移入条件为光/暗周期14 h/10 h，昼夜温度20 ℃/10 ℃的人工气候室内，待缓苗24 h后进行试验处理。设置常温+蒸馏水处理（CK）；5 ℃根区亚低温+蒸馏水处理（L）；5 ℃根区亚低温+90 mmol·L-1蔗糖处理（L+S）；5 ℃根区亚低温+90 mmol·L-1蔗糖+300 μmol·L-1IAA合成抑制剂4-联苯基硼酸处理（L+S+BBo）共4个处理。各处理方法见表1。浇灌溶液体积约为100 mL，以营养钵土浇透为宜，每个处理15 株，3 次生物学重复，并于处理后0，24，48 h进行取样，将苗子根系用蒸馏水冲洗干净，取白色幼嫩根系，用液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存。

表1 外源蔗糖及IAA抑制剂处理方法Table 1 Treatment methods of exogenous sucrose and IAA inhibitor

1.3 测定项目与方法

1.3.1 IAA含量的测定 IAA提取参考QI等[21]的方法，稍作改动。为了提取IAA，取植物根系0.1 g加入1 mL预冷的磷酸缓冲液（pH 7.4）进行充分提取，2 000～3 000×g，4 ℃，离心20 min，收集上清液待测。然后按照制造商的说明，使用IAA ELISA试剂盒分析IAA含量。

1.3.2 渗透调节物质含量测定 游离脯氨酸含量参考ALI 等[22]的方法测定；可溶性总糖和淀粉含量参考邹琦等[23]的方法测定；山定子根系糖（蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇）含量参考陆晓晨[3]的方法测定。

1.3.3 蔗糖代谢酶活性的测定 蔗糖代谢关键酶的提取和活性测定参考田红梅等[24]的方法。

1.3.4 相对基因表达量测定 植物RNA 提取参考ASIF 等[25]的CTAB 法，稍作改动。在NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找蔷薇科苹果属（Malus domestica）与蔗糖代谢关键酶相关基因序列，利用Primer 3.0软件设计基因特异性引物（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成。cDNA稀释10倍后进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR），使用SYBR Green I试剂盒，基因的相对表达量用2-ΔΔCT方法计算。

表2 qPT-PCR引物序列Table 2 qPT-PCR primer sequence

1.3.5 根系活力测定 参照LIU 等[27]的方法。取0.5 g 鲜样加入0.4%氯化三苯基四氮唑（TTC）和66 mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 7.0）各5 mL，37 ℃暗处理3 h，485 nm比色。

1.4 数据分析

试验数据采用Statgraphics 18 软件对数据进行统计分析。采用单因素（one-way ANOVA）进行方差分析和多重比较（p＜0.05）。利用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系内源IAA含量的影响

由图1可知，L处理在48 h显著降低了根系中IAA含量，与对照（CK）相比降低23.69%。与L处理相比，L+S处理后显著增加了亚低温下根系内源IAA 含量，在24 h 和48 h 分别增加12.42%和14.44%，说明蔗糖诱导了山定子根系中IAA的积累。与L+S处理相比，L+S+BBo处理显著降低了根系IAA含量，在24 h和48 h分别使根系中IAA含量降低24.72%和33.12%，说明BBo有效抑制了添加蔗糖后根区亚低温下根系内源IAA的积累。

图1 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系内源IAA含量的影响Figure 1 Effects of exogenous sucrose and IAA inhibitors on endogenous IAA content in roots of M.baccata Borkh.under sub-low temperature

2.2 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系游离脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性总糖和淀粉含量的影响

由图2 可知，与CK 处理相比，L 处理使山定子根系中游离脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性总糖含量显著增加，而淀粉含量先降低后升高，在48 h 显著高于CK 处理。与L 处理相比，L+S 处理使山定子根系中游离脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性总糖和淀粉含量均显著增加。与L+S处理相比，L+S+BBo处理显著降低根系中游离脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性总糖和淀粉含量。

图2 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系游离脯氨酸（A）、可溶性蛋白（B）、可溶性总糖（C）和淀粉含量（D）的影响Figure 2 Effects of exogenous sucrose and IAA inhibitors on free proline（A）, soluble protein（B）, total soluble（C）sugar and starch contents（D）in roots of M.baccata Borkh.under sub-low temperature

2.3 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系蔗糖代谢的影响

2.3.1 SPS和SS（合成）活性 由图3可知，与CK相比，L处理显著增加了根系中SPS 和SS（合成）活性。与L 处理相比，L+S 处理后显著增加了根系中SPS 和SS（合成）活性。与L+S 处理相比，L+S+BBo 处理显著降低了SPS和SS（合成）活性。说明内源IAA 可能参与外源蔗糖调节根区亚低温胁迫下根系中蔗糖合成方向酶的活性。

图3 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系SPS（A）、SS（B）（合成）活性的影响Figure 3 Effects of exogenous sucrose and IAA inhibitors on SPS（A）and SS（B）(synthesis) activities in roots of M.baccata Borkh.under sub-low temperature

2.3.2 AI、NI和SS（分解）活性 由图4可知，与CK处理相比，L 处理下山定子根系AI 活性显著增加，NI 活性无明显变化，SS（分解）活性在48h 显著降低。与L 处理相比，L+S 处理使山定子根系中NI 活性显著增加，AI 和SS（分解）活性在48h 显著增加。与L+S 处理相比，L+S+BBo 处理使根系中NI、SS（分解）活性显著降低，AI活性在48h显著降低。

图4 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系AI（A）、NI（B）和SS（C）（分解）活性的影响Figure 4 Effects of exogenous sucrose and IAA inhibitors on AI（A）, NI（B）and SS（C）(decomposition) activities in roots of M.baccata Borkh.under sub-low temperature

2.3.3 蔗糖代谢关键酶基因表达量 由图5 可知，与CK 相比，L 处理诱导根系中MdSPS1、MdSUS2、MdSUS3、MdCWINV和MdNINV1显著上调表达，MdA-INV显著下调表达，MdNINV3表达无显著变化。与L处理相比，L+S处理使山定子根系中MdSPS1、MdSUS2、MdSUS3、MdCWINV、MdNINV1和MdNINV3基因显著上调表达，MdAINV表达在48 h显著上调。与L+S处理相比，L+S+BBo处理使山定子根系中MdSPS1、MdSUS2、MdSUS3、MdCWINV均显著下调表达，MdNINV1和MdNINV3表达在24h显著下调，MdA-INV表达量无明显变化。

图5 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系蔗糖代谢关键酶基因表达量的影响Figure 5 Effects of exogenous sucrose and IAA inhibitors on gene expression of key enzymes of sucrose metabolism in roots of M.baccata Borkh.under sub-low temperature

2.3.4 糖组分含量 由图6 可知，蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇四种糖组分总含量在不同处理下的变化趋势与可溶性总糖变化一致。其中与CK 处理相比，L处理显著增加了蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量。与L处理相比，L+S处理诱导山定子根系中蔗糖、果糖和山梨醇含量显著增加，葡萄糖含量在48h显著增加。与L+S处理相比，L+S+BBo处理使根系中蔗糖、葡萄糖和山梨醇含量显著降低，果糖含量先增加后减少。在四种糖组分中，蔗糖和山梨醇占比较大，对总可溶性糖水平变化影响较大。

图6 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系糖组分的影响Figure 6 Effects of exogenous sucrose and IAA inhibitors on carbohydrates content in roots of M.baccata Borkh.under sub-low temperature

2.4 外源蔗糖及IAA抑制剂对亚低温下山定子根系活力的影响

由图7 可知，与CK 处理相比，L 处理降低了山定子根系活力，并在处理48 h 达到显著水平，降低14.26%。与L 处理相比，L+S 处理后显著增加了根系活力，在24 h 和48 h 分别增加31.62%和37.64%。与L+S 处理相比，L+S+BBo处理显著降低了根系活力，在24 h和48 h使根系活力分别降低28.16%和34.68%。

2.5 相关性分析

进一步对不同处理下根系内源IAA 含量与糖组分及糖代谢相关酶活性进行了相关性分析。由图8 可知，IAA含量与果糖含量呈显著负相关，与其他生理指标无显著相关性。而果糖含量与蔗糖、葡萄糖和山梨醇含量呈显著正相关。

3 讨论与结论

3.1 外源蔗糖对根区亚低温下根系IAA水平的调控

生长素在植物生长发育中起着至关重要的作用。众多研究表明，低温胁迫会通过影响生长素的运输系统和代谢水平进而影响其含量和分布[28]。前期研究表明，根区亚低温处理会降低根系MdYUC8和MdPIN1的表达。而YUC 基因参与调节IAA 生物合成途径，促进IAA 积累，PIN1是IAA 极性转运蛋白，低温胁迫抑制IAA 的极性运输[29-30]。本研究中根区亚低温处理48h 能够显著降低山定子根系中IAA 含量，可能是通过降低根系MdYUC8和MdPIN1的表达，进而降低IAA 的合成。蔗糖可能在调节植物IAA 水平中发挥着重要作用。研究表明，铬胁迫使IAA的运输受到抑制，通过在含铬的培养基上添加蔗糖，可以使拟南芥根系正常生长，改善了细胞活性，调节IAA 分布和运输，说明蔗糖与IAA 可能密切相关[31]。在本研究中，外源蔗糖处理提高内源IAA 含量，且不同程度提高了根区亚低温下山定子根系中蔗糖代谢相关酶活性及其相关基因表达水平，促进根系蔗糖、果糖和山梨醇含量显著增加。因此我们猜测IAA 可能参与外源蔗糖调控根区亚低温下山定子根系蔗糖代谢。为研究内源IAA 是否参与蔗糖调控低温胁迫下植物根系渗透调节和蔗糖代谢，本研究设置IAA 合成抑制剂（BBo）处理，且结果表明添加BBo能显著降低根系IAA水平。

3.2 IAA参与外源蔗糖调节亚低温下根系渗透调节物质

在非生物胁迫下，植物通过主动积累渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等来调节细胞渗透压，进而保护细胞膜系统免受非生物胁迫的侵害。本研究中，L 处理显著增加了山定子根系中游离脯氨酸、可溶性总糖和可溶性蛋白含量，这与SUN 等[32]研究结果一致，低温条件促进甘蔗根中脯氨酸、可溶性总糖和可溶性蛋白含量增加，调节细胞渗透压，维持细胞结构完整，从而缓解低温胁迫。研究表明，在培养基上微繁殖的未接菌的葡萄外植体在低温下可溶性总糖和淀粉同步增加，这可能是由于培养基中的蔗糖促进了淀粉的持续合成[33]。本研究中L+S 处理使根区亚低温下山定子根系中可溶性总糖和淀粉含量增加，这可能是因为植物根系吸收了外源蔗糖后，部分提高了可溶性糖的含量，而另一小部分则促进淀粉的合成。在植物的整个生命周期中，IAA是调节植物生长和发育的关键因素。有研究表明，内源性IAA导致部分氨基酸和碳水化合物特别是多糖和糖醇等代谢物的积累，有利于拟南芥幼苗响应干旱胁迫[34]。本研究中，L+S 处理使亚低温下根系内源IAA 含量增加，而L+S+BBo 处理后减少了根系内源IAA 含量，削弱了外源蔗糖促进根系中游离脯氨酸、可溶性总糖、可溶性蛋白和淀粉的积累效果，这不利于保持细胞内渗透势的稳定性，说明内源IAA 的水平与渗透调节密切相关。因此推测，外源蔗糖可能部分通过增加内源IAA含量，促进根系中游离脯氨酸、可溶性总糖、可溶性蛋白和淀粉积累，调节山定子根系响应根区亚低温胁迫。

3.3 IAA参与外源蔗糖调节亚低温下根系蔗糖代谢过程

植物中的蔗糖代谢关键酶SPS 促进蔗糖合成，NI 和AI 将部分蔗糖分解产生葡萄糖和果糖，SS 催化蔗糖可逆转化为葡萄糖和果糖[35]。低温会引起蔗糖代谢酶活性变化，导致其糖组分含量发生改变。本研究结果表明，L 处理显著增加了根系中蔗糖合成方向SPS 和SS（合成）活性，上调了山定子根系蔗糖合成的酶基因MdSPS1、MdSUS2和MdSUS3表达量，SPS 活性与其基因表达量一致，诱导根系蔗糖积累量增加。这与JIANG 等[36]结果类似，在低温胁迫下，葡萄植株中SPS表达与蔗糖浓度密切相关，SPS表达量最高时，蔗糖浓度达到最大值。L 处理显著增加了根系蔗糖分解方向AI活性，诱导酸性转化酶基因MdCWINV表达上调，AI的高水平蔗糖降解酶活性使蔗糖迅速分解为其他糖，表明在根区亚低温下AI在蔗糖的分解中占主导作用，即AI活性的增加是根系中还原糖含量增加的原因。这与JIANG 等[37]结果一致，在低温条件下，葡萄（Vitis viniferaL.）枝条中葡萄糖和果糖的积累与AI 活性之间呈极显著的正相关。山梨醇是蔷薇科植物中最主要的光合产物，当植物受到胁迫时，它会在植物中大量累积，以增强植物的耐寒能力。本研究结果发现，在山定子根系中山梨醇含量最高，其次是蔗糖含量，果糖和葡萄糖较低，山梨醇含量的增加也意味着山定子耐低温能力的增强。

研究表明，外源蔗糖预处理可提高低温下黄瓜幼苗AI 和NI 活性，诱导内源性蔗糖、果糖和葡萄糖水平升高[14]。蔗糖代谢相关酶活性增加，导致蔗糖、葡萄糖和果糖等糖含量增加。本研究中，外源蔗糖处理提高内源IAA含量，且不同程度提高了根区亚低温下山定子根系中蔗糖代谢相关酶活性及其相关基因表达水平，促进根系蔗糖、果糖和山梨醇显著增加。而添加IAA 抑制剂处理后抑制内源IAA 含量，影响蔗糖代谢过程，表现为蔗糖合成与分解酶活性及其相关基因表达不同程度降低，进而引起糖组分变化。相关研究表明，IAA可能参与棉花可溶性糖及蔗糖代谢相关酶活性的调控[38]。且有研究发现，茭白内源IAA 含量变化会影响SPS、NI活性和蔗糖、葡萄糖、果糖等含量[39]。基于此，推测外源蔗糖可能通过增加内源IAA含量，促进蔗糖代谢关键酶活性及其相关基因表达，进而引起糖组分变化。而通过相关性分析发现，IAA 含量与果糖含量呈显著负相关，二者的内在联系还需进一步研究。

综上所述，根区亚低温会降低山定子根系IAA 含量和根系活力，增加渗透调节物质，促进蔗糖代谢相关基因表达和酶活性，使蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量显著增加。外源蔗糖可能通过促进根系内源IAA 含量增加，进而提高渗透调节物质，促进根系蔗糖代谢过程，提高根系活力。