土壤干旱对樟子松的影响及与松枯梢病发生的关系

尹大川，孟凡君，张天泽

（沈阳农业大学林学院，沈阳 110161）

樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolica）由于其耐寒、抗旱和速生的生长特性，被引种至我国科尔沁沙地进行防风固沙以来，已成为我国北方荒漠化地区的主要造林树种[1]。但是自20 世纪90 年代以来，樟子松人工固沙林开始出现大面积衰退现象，其衰退主要表现在枝梢枯黄、生长量减少、病虫害发生、继而全株死亡且不能天然更新[2-5]。近年来，随着全球气候的变化，干旱日益频发，水资源的短缺导致樟子松人工林的衰退加剧[6]。研究发现，干旱胁迫会导致植物细胞代谢过程中的活性氧（ROS）大量积累，细胞膜脂化加剧并产生丙二醛（MDA），进而对植物细胞的结构和功能造成损伤，影响植物的生长发育[7-8]。为了解毒活性氧，植物会通过提高抗氧化酶活性来减轻脂质过氧化对植物细胞的损伤，保护膜的完整性[9]。

随着樟子松人工林的衰弱，其病害的发生也日益严重，其中樟子松枯梢病是最主要的病害之一[10]。樟子松枯梢病是由松球壳孢菌（Sphaeropsis sapinea）引起的一种典型的寄主主导型病害，同时也是一种发生普遍、危害严重的林木传染性病害[11]。该病从樟子松幼苗至成林均可发病，可引起樟子松枯枝、枯针、枯梢、枯芽、根茎腐烂等症状，严重时甚至可导致整株枯死[12]。其病原菌可以在健树上潜伏，待寄主生长衰弱时，便会侵染寄主引起发病[13]。对于该病的防治，目前化学防治仍占主导地位，但在化学防治带来良好效果的同时也造成了环境的污染和生态平衡的破坏[14]。

樟子松枯梢病的发生是寄主植物和病原菌与生态环境相互作用的结果，其中寄主本身生长势降低是樟子松枯梢病发生和流行的主要诱因，而干旱胁迫往往会加重这种诱因[15]。有关干旱胁迫与枯梢病的关系已有大量研究报道，研究发现，当植株缺水时，会更易激活病原菌并引起发病[16-17]。通过对红松幼苗研究发现，未浇水的幼苗感染枯梢病的死亡率均较高，而反复浇水的幼苗受到病原菌感染的死亡率均较低，说明病原菌在干旱条件下侵染力明显加强[18-19]。但关于干旱下樟子松枯梢病的发病情况并未见过多研究，因此，本试验通过研究干旱胁迫下樟子松幼苗的生长状况、部分生理响应以及樟子松枯梢病的发病情况，为进一步探讨干旱地区樟子松造林以及水分影响下的樟子松人工林衰退问题提供借鉴和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

樟子松种子采自辽宁省阜新市章古台实验林场。樟子松枯梢病病原菌松球壳孢菌分离自辽宁省固沙造林研究所章古台实验林场樟子松人工林内感病樟子松。

1.2 方法

种子处理：将试验所用的樟子松种子进行消毒催芽。出芽后，将萌发的种子放入装有无菌土的营养钵内进行培养。待幼苗出土后，定苗至每盆3株。

病原菌培养与接种：将保存的枯梢病病原菌用PDA 培养基进行活化，待平板长满后用打孔器接种于PD 培养液内，每300 mL 的PD 培养液内放10 块直径5 mm 的菌块，后放入摇床，在25 ℃，150 r·min-1的条件下摇床培养4天。摇培后拿出将菌块打碎并放入喷壶中，待樟子松幼苗干旱处理后，将其直接喷雾接种于试验处理中的樟子松幼苗。接种后将幼苗放入23 ℃、光照12 h·d-1的培养室继续进行干旱胁迫试验。

在出苗3个月后，选取长势稳定相似的苗木30盆，分为3组，每组10盆，用于樟子松干旱胁迫试验，此试验采取3 种不同的处理：对照CK（80%FWC）、中度干旱MD（40%FWC）和重度干旱HD（20%FWC）[20]。在出苗后对每组樟子松进行相应的处理，土壤的含水量运用称重补水法进行保持，即每天对每盆樟子松苗木进行称重，补充丧失的水分以保持相应土壤含水量稳定。幼苗在处理两个月后收获并进行指标测定。

另同样选取长势相似樟子松幼苗60 株，分为3 组，每组20 盆，每盆1 株苗木。与上述同样分为3 组处理（CK、MD和HD）并同时进行干旱胁迫，每个处理5个重复。干旱处理结束后用于病原菌接种试验。3个处理即为：CK（80%FWC）×接菌组；MD（40%FWC）×接菌组；HD（20%FWC）×接菌组。

1.2.1 樟子松干旱条件下的生存分析 出苗后选取30 株长势相似的樟子松幼苗，对其进行不浇水处理，观察其生存状态并每天记录其死亡与剩余生存的植株数，待全部死亡后，将数据进行整理并分析。

1.2.2 樟子松针叶相对电导率测定 从每组处理中随机取8 棵樟子松幼苗，每棵樟子松幼苗中随机取8 枚针叶，每组处理24枚，共72枚针叶。随后用去离子水冲洗干净，从每枚针叶中部切取10 mm，将同一个处理的24段平均放入3 个试管中，每管8 段，共9 个试管，即每个处理3 个重复。然后分别在每个试管中加入12 mL 的去离子水。另外再取3支试管，每管中加入12 mL 水作为空白对照，对每个试管进行封口并标号记录。之后将试管放入摇床（150 r·min-1）中摇22 h。用电导仪测初始电导值C1和空白对照组C空白1。测完后继续封口并放入沸水煮沸30 min，之后再放入摇床（150 r·min-1）振荡22 h，再用电导仪测出最终电导值C2以及空白组的最终电导值C空白2。用式（1）算出每组相对电导率（REL）。

1.2.3 樟子松针叶活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）含量测定 准确称取樟子松针叶、茎、主根和侧根各0.1 g，按质量体积比加入生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，10 000 r·min-1离心10 min。取上清液待测。每个处理进行3次重复。过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O.ˉ

2）采用南京建成试剂盒进行测定。准确称取樟子松针叶、茎、主根和侧根各0.5 g，用5 mL 蒸馏水研磨4 000 r·min-1离心15 min，留上清液，取上清液1 mL，用容量瓶定容到100 mL，稀释10倍。每个处理进行3次重复。MDA采用南京建成试剂盒进行测定。

1.2.4 樟子松针叶超氧阴离子及膜透性染色 使用氮蓝四唑（NBT）染色法来表征樟子松针叶中的O2.-的积累。材料胁迫处理后,取针叶置于离心管中，加入NBT 染色液,室温染色过夜。染色结束后,用脱色液（冰乙酸∶无水乙醇=3∶1）进行脱色[21]。

运用伊文思蓝（Evans Blue）染色可指示膜的完整性。材料胁迫处理后,取针叶置于离心管中,加入Evans Blue染色液,室温染色过夜。染色结束后,用脱色液（冰乙酸∶无水乙醇=3∶1）进行脱色[22]。

1.2.5 樟子松针叶抗氧化酶活性测定 超氧化物歧化酶（SOD）粗酶液制备：准确称取樟子松针叶、茎、主根和侧根各0.1 g，液氮研磨，按质量体积比加入pH 50 mmol·L-1冷磷酸缓冲液10 mL，4 ℃、10 000 r·min-1低温离心20 min，上清液即为粗酶液[23]。每个处理进行3次重复。SOD活性采用购自南京建成试剂盒进行测定。

过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）粗酶液制备：准确称取樟子松针叶、茎、主根和侧根各0.1 g，液氮研磨，按质量体积比加入pH 值7.0 的50 mmol·L-1冷磷酸缓冲液10 mL，4 ℃、10 000 r·min-1低温离心20 min，上清液即为粗酶液[24]。采用购自南京建成试剂盒进行POD、CAT活性的测定。每个指标进行3个生物学重复。

1.2.6 樟子松枯梢病发病率和病情指数测定 樟子松幼苗接种病原菌后，继续进行干旱胁迫试验并每天观察发病情况，30 d后统计发病率及发病指数[25]。。

表1 樟子松枯梢病发病等级划分Table 1 Classification of the incidence of P.sylvestris var. mongolica shoot blight

1.2.7 樟子松枯梢病的发生与干旱的关系 不同干旱处理对樟子松枯梢病的影响非采用隶属函数法进行综合评价。参照李国花等[26]的隶属函数分析方法，隶属函数值的计算方程为：

式中：R（Xi）代表第i个指标的隶属函数值；Xi表示第i个指标值；Xmin表示第i个指标的最小值；Xmax则表示第i个指标的最大值。根据上述公式分别计算出各处理的发病率以及病情指数的隶属函数值，然后再取其算术平均数作为平均隶属函数值，其数值越大，说明该处理的综合评价越好，越不易感染枯梢病。

1.3 数据处理方法

数据处理采用SPSS 软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），图表制作运用Excel 2010 和GraphPad Prism 7.0软件。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下樟子松幼苗的生存分析

樟子松在干旱下的生存曲线如图1。在持续干旱下，樟子松幼苗在从第83天开始陆续死亡，并在150天内全部死亡。樟子松的生存率随着干旱时间的增加而逐渐减小。其中，在不浇水后第100天，30棵幼苗生存率下降到63.33%。在第120 天，生存率下降到30%，并在第145 天所有植株全部死亡，生存率达到0，中位生存期为111 d。可以看出，在前82 d内植株生长势虽然减弱，但仍存活，说明幼苗具有一定的抗旱性。但在持续干旱条件下，樟子松自身调节达到极限，水分缺失得不到缓解，最终表现为植株死亡。

图1 干旱胁迫下樟子松幼苗的生存曲线Figure 1 Survival curves of P.sylvestris var. mongolica seedlings under drought stress

2.2 干旱胁迫下樟子松幼苗的针叶相对电导率变化

干旱胁迫显著增加了樟子松针叶的相对电导率（图2）。由图2可知，樟子松幼苗针叶无论是在中度干旱还是在重度干旱下，相对电导率均有不同程度的上升，且MD 组和HD 组与CK 组相比均有显著差异（p＜0.05）。在试验结束后，MD 处理组和HD 处理组分别上升至52.23%和64.27%。与CK 组相比，MD 处理组显著上升49.06%，HD处理组显著上升83.42%（p＜0.05）。

图2 不同干旱胁迫处理后樟子松幼苗针叶的相对电导率Figure 2 Relative electrical conductivity of needles in P.sylvestris var. mongolica seedlings after different drought stress treatments

2.3 干旱胁迫下樟子松幼苗ROS和MDA含量变化

随着干旱胁迫程度的加剧，与对照组相比，樟子松幼苗主根、侧根、茎和叶中的O2.-的含量不断增加（图3）。其中在中度干旱胁迫下，樟子松幼苗主根、侧根、茎和针叶中的O.ˉ2的含量与对照组相比分别增加29.6%、8.81%、5.31%和21.04%，但没有显著差异（p＞0.05）。而在重度干旱胁迫下，与对照组相比，除了主根外，樟子松幼苗的侧根、茎和叶的O.ˉ2的含量与对照组相比均有显著差异，且分别显著增加5%、33.17%和30.84%（p＜0.05）。

图3 不同干旱胁迫处理后樟子松幼苗O.ˉ2含量Figure 3 O.ˉ2 content of P.sylvestris var. mongolica seedlings after different drought stress treatments

由图4可知，干旱胁迫导致了樟子松幼苗各部位中H2O2含量的上升。在中度干旱胁迫下，樟子松幼苗侧根的H2O2含量与对照组相比提高68.49%，且与对照组间差异显著（p＜0.05）。而对于主根的H2O2含量与对照组相比也有所提高，但与对照组相比却无显著差异（p＞0.05）。在重度干旱下，樟子松幼苗的主根和侧根与对照组相比均显著增加，且分别增加57.16%和66.83%（p＜0.05）（图4A）。在樟子松幼苗的茎中，中度干旱处理组与对照组相比有所上升，而重度干旱下却稍有下降，但各组间均无显著差异（图4B）。对于樟子松幼苗针叶中的H2O2含量来说，只有重度干旱胁迫下与对照组相比具有显著差异，显著提高170.23%（p＜0.05）（图4C）。

在本研究中，樟子松幼苗主根、侧根、茎和针叶的MDA 含量随着干旱胁迫程度的增加而逐渐增加（图5）。在中度干旱胁迫下，樟子松幼苗茎中的MDA 含量与对照组相比显著上升，且上升48.10%（p＜0.05），而主根、侧根和茎中的MDA 含量与对照组相比则无显著差异（p＞0.05）（图5A、图5B 和图5C）。在重度干旱下，与对照组相比，樟子松幼苗的主根、侧根、茎和针叶中的MDA 含量均显著上升，分别上升97.5%、85.71%、88.61%和31.25%（p＜0.05）。而与中度干旱组相比，只有主根和茎中MDA含量具有显著差异（p＜0.05）（图5A和图5B）。

图5 不同干旱胁迫处理后樟子松幼苗MDA含量Figure 5 MDAcontent of P.sylvestris var. mongolica seedlings after different drought stress treatments

2.4 干旱胁迫下樟子松幼苗的针叶组织化学染色分析

NBT 能被植物组织中的O.ˉ2氧化成蓝色沉淀。在本研究中，对照组CK 几乎没有被染上蓝色，而在MD 处理组下，樟子松针叶上已经出现蓝色斑点。在HD 处理下，针叶上的蓝色斑点增多且加深（图6）。这说明干旱胁迫的加剧也增加了对针叶中的O.ˉ2含量，这也初步表明细胞膜的氧化程度增加。自身质膜完整性的破坏。

Evans blue 染色可以将细胞膜破损和丧失活性的细胞染成蓝色，通过其染色程度来表明细胞的受损程度。通过观察发现，CK 组无明显变化，说明此时细胞膜受损程度较小。随着干旱程度的加剧，MD 组和HD 组的着色逐渐加深和变大（图6）。说明随着干旱胁迫的加剧，樟子松幼苗针叶细胞膜受损程度增加。

图6 不同干旱胁迫处理后樟子松幼苗针叶NBT和Evans blue染色结果Figure 6 NBT and Evans blue staining of P.sylvestris var. mongolica seedlings after different drought stress treatments

2.5 干旱胁迫下樟子松幼苗的抗氧化物酶活性变化

由图7可知，随着干旱胁迫的程度增加，植物各部位的SOD活性均呈先上升后下降的趋势。在重度干旱下达到最大值。就樟子松幼苗的侧根与针叶而言，中度干旱处理组的SOD 活性与对照组相比均显著上升，分别上升163.51%和112.17%(p＜0.05)。重度干旱处理组相比中度干旱处理组有显著下降趋势，但仍高于对照组，而与对照组相比却无显著差异(p＞0.05)(图7A、图7C)。对于樟子松幼苗的主根和茎而言，中度干旱胁迫处理组与重度干旱胁迫组与对照组相比均有显著差异，中度干旱处理组SOD 活性与对照组相比显著增加189.68%和85.59%。在重度干旱下SOD活性则稍低于中度干旱，但仍显著高于对照组(p＜0.05)(图7A、图7B)。

图7 不同干旱胁迫处理对樟子松幼苗SOD活性的影响Figure 7 Effect of different drought stress treatments on SOD activity in P.sylvestris var. mongolica seedlings

随着干旱胁迫程度的加剧，供试樟子各部位的POD活性都出现了不同程度的变化(图8)。对于樟子松幼苗的主根、侧根和茎而言，中度干旱胁迫下的POD 活性与对照组相比均产生了显著差异，且分别上升25.05%、12.52%和19.97%(p＜0.05)。而重度干旱处理组则与对照组相比略有上升，但均无显著差异(p＞0.05)(图8A、图8B)。而樟子松幼苗的针叶中的POD 活性不管在中度干旱还是在重度干旱下均与对照组相比显著升高，且分别增加230.9%和169.74%(p＜0.05)(图8C)。

图8 不同干旱胁迫处理对樟子松幼苗POD活性的影响Figure 8 Effect of different drought stress treatments on POD activity in P.sylvestris var. mongolica seedlings

与对照组相比，中度干旱胁迫下的樟子松幼苗主根、侧根、茎和针叶的CAT 活性均显著升高，分别比对照组增加了30.16%、16.85%、16%和23.64%(p＜0.05)。中度干旱诱导樟子松幼苗各部位的CAT 加速合成，活性升高。而当樟子松幼苗处于重度干旱下，只有供测樟子松幼苗的茎中与对照组相比具有显著差异，显著上升3.95%(p＜0.05)(图9)。

图9 不同干旱胁迫处理对樟子松幼苗CAT活性的影响Figure 9 Effect of different drought stress treatments on CAT activity in P.sylvestris var. mongolica seedlings

2.6 干旱胁迫下樟子松幼苗的发病率与病情指数

由表2可知，在接种后第30天，樟子松各处理间的发病率与病情指数存在显著差异（p＜0.05）。从发病率来看，在CK组正常浇水的情况下，30 d植株发病率仅有26%，随着干旱胁迫的加剧，植株的发病率逐渐上升，尤其在HD 处理下，枯梢病发病率则达到96%。同样的，在接种后第30 天，CK 组病情指数为8，而在MD 处理和HD处理下的植株病情指数则达到24.25 和65.25，且每组之间均存在显著差异（p＜0.05）。即干旱胁迫显著提高了樟子松枯梢病的发病率与发病指数。

表2 樟子松枯梢病发病率与病情指数Table 2 The incidence rate and disease index of P.sylvestris var. mongolica shoot blight

2.7 干旱与樟子松枯梢病发生的隶属函数分析

由表3 可知，CK 组的隶属函数均值最大达到0.56，其次是MD 组和HD 组，分别为0.49 和0.46。可知，随着干旱胁迫的加剧，其隶属函数值均值逐渐减小，即干旱对枯梢病发生的影响随着其程度的加剧逐渐增大，干旱胁迫致使樟子松更易感染枯梢病。

表3 不同处理对樟子松枯梢病发生的综合评价Table 3 The evaluation of the occurrence of P.sylvestris var. mongolica shoot blight by different treatments

3 讨论与结论

3.1 干旱胁迫对樟子松幼苗ROS和MDA含量的影响

研究发现，干旱胁迫可以促使植物细胞内的ROS积累，同时细胞膜脂过氧化反应进而产生MDA，使细胞膜上的蛋白质失活、降低保护酶活性和破坏膜的完整性，进而影响植物细胞结构和功能，造成膜系统的损伤，进而引起代谢紊乱[8,27]。在本研究中，樟子松幼苗的主根、侧根、茎和叶随着干旱胁迫的加剧，O.ˉ2、H2O2和MDA 含量都出现了不同程度的升高，这与前人的研究结果一致[28-30]。其中在中度干旱下，樟子松幼苗的主根、侧根和针叶中的MDA 含量与对照组相比虽有所增高，却并无显著差异（p＞0.05）。而在重度干旱胁迫下，各器官MDA 含量与对照组相比均呈显著上升（p＜0.05）。这与其他植物在干旱下的MDA 含量变化一致[31-32]。同时，随着干旱胁迫的加剧，樟子松幼苗针叶中相对电导率逐渐升高，针叶NBT 和Evans blue 染色加深，这也与前人报道结果一致[33-36]。以上研究结果说明干旱胁迫下樟子松幼苗体内ROS 产生和消除平衡受到了影响，脂质过氧化程度加深。干旱胁迫对樟子松幼苗细胞产生了伤害，细胞膜透性变大，且在重度干旱下，植株体内MDA含量大量积累，樟子松幼苗质膜受到的伤害最大。而其中在中度干旱胁迫下，主根、侧根和针叶中MDA含量上升幅度相对较小可能是由于此时根系和针叶通过增加脯氨酸含量以及提高抗氧化酶活性在一定程度上缓解了植株的脂膜过氧化，增加自身对水分亏缺的适应性。

3.2 干旱胁迫对樟子松幼苗抗氧化酶活性的影响

ROS清除机制是植物对抗非生物胁迫的常见的防御反应之一。SOD、POD、CAT 作为酶促系统中的主要酶会通过增加自身活性来提高对氧化胁迫的抗性，减少氧化损伤并保护细胞结构，增强植物自身抗旱能力[37]。据报道，受到干旱胁迫的耐旱水稻品种叶片中的POD 活性逐渐增加[38]。紫花苜蓿的根和叶中的SOD及叶片中的POD 活性在干旱胁迫下均显著上升[39]。研究指出，在干旱胁迫下，不同植物保护酶活性有差异，抗旱性强的植物的SOD、CAT、POD 活性较高，能有效清除活性氧，抑制膜脂过氧化[40]。在本研究中，樟子松幼苗主根、侧根、茎和针叶中的SOD、POD、CAT 活性随着干旱胁迫的加剧呈现出先上升后下降的趋势。在中度干旱胁迫下，樟子松幼苗各器官的抗氧化酶体系的变化，说明其在一定程度上能调动自身膜保护酶的活性，消除活性氧，减轻膜质过氧化，提高樟子松幼苗的抗旱性。而在重度干旱胁迫下，樟子松幼苗各器官的酶活出现下降的趋势，这说明此时植株体内的酶促系统遭到破坏，樟子松幼苗清除活性氧的能力被严重削弱。根据研究结果中不同程度干旱胁迫下不同器官抗氧化酶活性之间的增幅和差异性，也表明了抗氧化酶活性的变化因胁迫程度、供试樟子松幼苗胁迫部位不同而异。

3.3 干旱胁迫对樟子松枯梢病发生的影响

樟子松枯梢病作为典型的寄主型主导病害，当寄主受到外界环境影响而生长势降低时，植株受到病原菌侵染，从而发病。而当寄主本身生长良好，抗病性强就不易发病[13]。水分是影响樟子松健康状况的主要因素[41]，而干旱造成的樟子松本身的水分胁迫更加剧了枯梢病的流行与爆发[42]。本研究针对干旱胁迫与樟子松枯梢病的发生关系进行了研究。利用实验室培养的病原菌真菌对不同处理的樟子松进行喷雾侵染。结果表明，中度干旱与重度干旱组植株30 d 发病率和病情指数均显著高于对照组，这说明干旱胁迫显著增加了樟子松枯梢病的发病率与病情指数，这与前人报道的结果一致[17,19,43]。这可能是由于干旱胁迫降低了植株体内的酶活性和一些固有的抗菌物质，增加了樟子松的质膜透性，使植株本身的生理生化活动受到影响，从而造成病害发生和加重。

樟子松在不同干旱胁迫下的对枯梢病抗性通过隶属函数来综合评价，隶属函数是基于模糊数学原理用于表征模糊集合的数学工具[44]。隶属函数分析是在多指标测定的基础上，对各植物特性进行综合性评价的一种分析方法，现已被广泛运用于植株抗逆性评价[45-46]。本研究运用模糊隶属函数法，利用发病率和病情指数两个指标的平均隶属函数值来综合评价3 个处理对樟子松枯梢病发病的影响。隶属函数值越小，植株受病原菌影响较小，其抗病性越强；值越大，植株受病原菌影响较大，其抗病性越弱。试验结果显示，随着干旱胁迫程度的加剧，其隶属函数均值也随之下降，由此证明干旱在影响樟子松生长发育的同时也减弱了樟子松对枯梢病的抗性。这与前人的研究结果一致[47]。究其原因，主要是由于樟子松枯梢病是一种由弱寄生菌引起的病害，干旱引起的水分胁迫降低了植株的生长势并导致植株抗病性降低，病原菌侵染能力加强，因而致使病害更易发生。

本研究结果表明，干旱胁迫会诱导樟子松幼苗活性氧积累，并导致膜质过氧化。而同时樟子松幼苗能通过调节抗氧化酶活性减轻干旱致使的氧化胁迫损伤，但在严重干旱胁迫下时，自由基产生和消除平衡彻底遭到破坏，活性氧大量积累，植株膜系统受损且抗氧化酶系统不能有效缓解，最终导致植株细胞加速衰老以及植物组织受损，严重影响了樟子松幼苗的生长发育，并致使樟子松生长衰弱。这也造成了樟子松本身对枯梢病的抗性的减弱，增加了樟子松枯梢病的发病率和病情指数，更进一步加剧了樟子松枯梢病（衰退病）的发生。