低温胁迫对芝麻芽期幼苗生长的影响与耐低温材料筛选

赵云燕,孙 建,梁俊超,王郅琪,颜廷献,颜小文,危文亮,乐美旺,*

(1.长江大学 农学院,湖北 荆州 434025; 2.江西省农业科学院 作物研究所,江西省油料作物生物学重点实验室,国家油料改良中心南昌分中心,江西 南昌 330200)

芝麻(SesamumindicumL.)是中国传统特色油料作物,距今已有两千多年的种植历史,是重要的油用原料和烹饪佐料[1-2]。近年来,随着人们对芝麻营养保健价值的认识,芝麻的消费需求逐年快速增加。但由于我国芝麻生产中存在品种抗逆性较差、产量高而不稳、比较效益不高等问题,导致种植面积逐年下降,中国已由优质芝麻产品主要出口国转变成了全球第一进口国,供需矛盾进一步加深[3]。因此,扩大芝麻种植范围,进一步拓展中国西部、北部芝麻种植区,增加总产量,是我国芝麻产业发展的重要目标之一。低温胁迫是影响植物生长发育和地理分布的重要环境因子,近年来低温冷害频发,导致作物产量持续下降[4-5]。芝麻起源于热带和亚热带地区,是一种对温度极其敏感的嗜热作物,其种子适宜的发芽温度为24～32 ℃[6]。在东北、华北和西北等芝麻种植区,低温严重限制了芝麻的生产,春播芝麻极易遭受芽苗期低温危害;而在江西、湖南等南方芝麻种植区,秋芝麻则易遭受寒露风低温威胁,影响后期授粉结实与籽粒发育,易造成大幅减产[7]。因此,开展芝麻耐低温研究,挖掘耐低温种质对芝麻产业发展具有重要的意义。

植物为响应低温环境,已演化出各种信号感知和应答途径,并在形态结构、基因表达、渗透调节物质积累与抗氧化酶的合成等方面发生了复杂的变化[8]。低温对植物形态结构影响显著,玉米芽期遭遇10 ℃低温时,叶片萎蔫、黄化,植株矮小[9]。水稻幼苗对低温的表现为生长迟缓、叶片萎缩、分蘖减少甚至组织坏死等[10]。吴雪霞等[11]研究发现,低温胁迫下茄子幼苗生长缓慢,株高、茎粗、叶长和叶宽均下降。棉花在播种后遭遇低温时,常造成烂种、烂芽、缺苗,导致生育期延迟,影响棉花产量和纤维品质[12]。目前,关于芝麻低温胁迫相关的研究报道较少,Wang等[13]研究表明,芝麻中几乎所有SibZIP成员都在4 ℃处理时表达量下调,但SibZIP35和SibZIP57在低温胁迫12 h时表达量显著上调。Zhang等[14]对芝麻NAC转录因子家族的全基因组鉴定表明,大多数SiNACs在低温处理时表达量下调,而SiNAC07、SiNAC21和SiNAC79的表达量显著上调。You等[15]发现,芝麻棉籽糖积累基因SiGolS2和SiGolS7在低温胁迫时表达量显著升高。植物通过体内生理活动变化来平衡低温对细胞渗透系统的冲击。茄子经低温胁迫后脯氨酸含量显著升高,且随着温度的降低,保护酶活性均显著上升[11]。邓仁菊等[16]研究表明,火龙果的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等含量均在低温胁迫下升高,在恢复生长后含量均呈下降趋势。李亚男等[17]研究表明,不同芝麻品种叶片中可溶性糖和可溶性蛋白含量在低温条件下均升高。对大量芝麻种质进行低温鉴定和评估是筛选低温耐受性极端材料的必要途径,而芽期胁迫评价是发掘抗耐性种质资源的重要方法之一,已广泛应用于植物干旱[18-19]、低温[20-22]、盐碱[23-24]、涝渍[25]等非生物胁迫鉴定。芽期耐逆性评价在芝麻耐盐性[26]、耐铝毒性[27]、耐旱性[28]、耐湿性[29]鉴定中应用广泛。前人对芝麻低温胁迫的研究集中在基因家族分析,鲜有芝麻低温耐受性鉴定相关的文献报道。本文通过研究低温胁迫对芝麻幼苗生长的影响,确定芝麻芽期耐低温评价方法和评价指标,筛选耐低温种质资源,探索芽期芝麻在低温胁迫下的生理响应机制,为芝麻耐低温种质资源发掘和育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为来自国内外的188份芝麻资源,以秦岭淮河和长江为界,将种植的地理区域分为北方地区(36份资源)、中部地区(111份资源)、南方地区(41份资源)。材料名称、来源与所属地理区域见表1。种子由江西省农业科学院作物研究所芝麻创新团队提供。

表1 供试芝麻种质信息Table 1 Information of sesame materials used in this study

续表1 Continued Table 1

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1.2 芽期温度处理方法与形态指标测定

在前期预实验的基础上,选取5份对低温敏感度差异较大的芝麻材料(和尚帽、上蔡白芝麻、小籽黄、一叶三、沙洋芝麻),进行不同温度梯度处理,然后测定形态指标,以确定合适的处理温度。参照孙建等[27]的方法,每份芝麻材料选取100粒饱满种子,用75%乙醇消毒后,再用蒸馏水冲洗3次;然后采用滤纸发芽法,将种子置于铺有3层滤纸的带盖发芽盒(10 cm × 10 cm × 5 cm),加入30 mL蒸馏水,于28 ℃恒温暗培养24 h;种子露白后分别置于28 ℃(对照)、25 ℃、21 ℃、18 ℃和15 ℃恒温培养箱暗培养。每份材料设置3次重复。处理6 d后,每盒选择10株生长一致的幼苗,测定根长、芽长、鲜重,并计算各指标相对值。通过比较不同温度处理后的各指标相对值,确定合适的芽期处理温度。各指标相对值按照以下公式计算。

(1)

(2)

(3)

式(1)～(3)中:lRR代表相对根长(relative root length,RRL),lTR和lCKR分别代表处理幼苗平均根长、对照幼苗平均根长;lRS代表相对芽长(relative shoot length,RSL),lTS、lCKS分别代表处理幼苗平均芽长、对照幼苗平均芽长;mRF代表相对苗鲜重(relative fresh weight,RFW),mTF、mCKF分别代表处理幼苗平均鲜重、对照幼苗平均鲜重。

1.3 种质资源耐低温评价与耐低温资源筛选

根据1.2节的结果,设置28 ℃为对照温度,18 ℃为处理温度,进一步对188份芝麻种质资源进行芽期低温耐受性鉴定评价。各材料的种子处理和形态指标测定方法与1.2节相同。基于各材料的根长、芽长、鲜重,计算各指标相对值,进行3个形态指标的相关性分析;并根据3个形态指标的相对值,计算其平均隶属函数值;再基于3个形态指标平均隶属函数值,利用SPSS软件组间联接法对188份芝麻种质进行聚类分析,以及低温耐受性评价和耐低温资源筛选。

1.4 生理生化指标测定

根据1.3节的评价鉴定结果,选取低温耐受性差异较大的2份芝麻材料——漯芝16号(高耐低温材料)和清油河芝麻(极不耐低温材料),低温处理后分析生理生化指标,以期初步探究芽期低温胁迫后芝麻的生理生化响应特征。具体方法是,在芽期低温处理6 d后,分别采集对照(28 ℃)、处理(18 ℃)的芝麻材料芽和根样品,液氮速冻后-70 ℃保存备用。采用酸性茚三酮比色法、蒽酮比色法、双缩脲法、分光光度法、硫代巴比妥酸法、紫外吸收法、氮蓝四唑法分别测定芝麻芽和根中游离脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖(SS)含量、可溶性蛋白(SP)含量、过氧化氢(H2O2)含量、丙二醛(MDA)含量,以及过氧化氢酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性[30]。各项指标均使用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒进行测定。每项指标3个生物学重复。

1.5 数据处理

采用Excel 2021软件进行数据分析,采用隶属函数值进行分析评价[31],用SPSS19.0软件进行相关性分析和聚类分析,使用Prism、Excel 2021软件制图。隶属函数值按以下公式计算。

μ(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

(4)

式(4)中,μ为隶属函数值,Xi为第i个综合指标,Xmin为第i个指标的最小值,Xmax为第i个指标的最大值,i=1,2,…,n。

2 结果与分析

2.1 温度对芝麻幼苗生长的影响与敏感温度的确定

以和尚帽、上蔡白芝麻、小籽黄、一叶三和沙洋芝麻共5份芽期对温度敏感度差异较大的芝麻种质为供试材料,在种子露白后分别置于28、25、21、18、15 ℃恒温暗培养,6 d后测定芽长、根长和苗鲜重。结果表明,温度对芝麻幼苗生长影响较大,随着温度的降低,幼苗芽和根的生长逐渐受到抑制(图1)。当温度降至18 ℃时,幼苗生长缓慢,胚根生长受到严重抑制。当温度降至15 ℃时,芝麻幼苗几乎不生长,无法形成正常幼芽。由此可见,15 ℃可作为芝麻幼芽生长的临界温度。

图1 不同温度下芝麻幼苗的生长情况Fig.1 Growth of sesame seedling under different temperatures

图2显示,随着温度的降低,所测定的3个性状指标相对值均不断降低。相对芽长在25～21 ℃下降缓慢,在18～15 ℃骤降(图2-A);相对根长和相对苗鲜重在21～15 ℃急剧下降(图2-B、图2-C)。综合以上各指标发现,暗培养温度为18 ℃时,芝麻相对芽长、根长和苗鲜重均极显著下降,且品种间的差异最为显著;因此,18 ℃可作为芝麻芽期耐低温鉴定的参考胁迫温度。

RSL, Relative shoot length; RRL, Relative root length; RFW, relative fresh weight. The same as below.图2 不同温度下芝麻芽期的相对芽长、相对根长和相对苗鲜重Fig.2 Relative shoot length, relative root length and relative fresh weight of sesame seedling at the early stage under different temperatures

2.2 芝麻种质资源评价

以28 ℃为对照温度,18 ℃为处理温度,对188份芝麻种质资源进行芽期低温鉴定。结果(图3)显示,188份供试材料3个形态指标的相对值均呈现正态分布。相对芽长为14.46%～79.48%,平均48.1%,变异系数为26.25,超过一半材料的相对芽长在36%～55%;相对根长为36.38%～92.32%,平均62.75%,变异系数为19.53,大部分材料的相对根长为56%～75%;相对苗鲜重为38.44%～97.32%,平均69.06%,变异系数14.33,88.9%的鉴定材料在低温胁迫下相对苗鲜重可达55%以上。由此可见,在18 ℃,芝麻根和芽的生长均受到不同程度的抑制,其中,对芽长的抑制作用最大,其次是根长和苗鲜重。相关性分析结果(表2)表明,3个形态指标相对值之间均表现为显著正相关,其中,相对芽长和相对苗鲜重的相关系数最高(r=0.873),这意味着这3个形态指标相对值在低温胁迫下的表现具有一致性,均可以作为芝麻芽期低温耐受性鉴定指标。

表2 三个低温耐受性形态指标的相关性Table 2 Correlation of 3 low-temperature tolerant related morphological traits

图3 低温胁迫下188份芝麻种质资源相对芽长、相对根长和相对苗鲜重的频次分布Fig.3 Frequency distributions of relative shoot length, relative root length and relative fresh weight of 188 sesame germplasm under low temperature stress

2.3 聚类分析

3个形态指标的平均隶属函数值为0.15～0.92,这说明188份芝麻资源的芽期低温耐受性差异较大。平均隶属函数值越高,其低温耐受性越强。根据3个形态性状的平均隶属函数值,利用SPSS软件组间联接法对188份芝麻种质进行聚类分析。结果(图4,表3)显示,在欧式遗传距离D=10处可以将188份芝麻资源分成5类:第Ⅰ类为高耐低温材料,包括驻芝19、鄂芝1号、驻芝16、沙洋芝麻、漯芝16号共5份种质(中部地区种质4份,南方种质1份),占供试材料的2.66%,其相对芽长为70.51%～79.48%,平均75.15%;相对根长为79.73%～92.26%,平均85.25%;相对苗鲜重为84.18%～97.33%,平均87.93%。第Ⅱ类为耐低温材料,包括冀航芝4号、皖芝5号等42份芝麻种质(9份北方芝麻材料、25份中部材料、8份南方材料),占供试材料22.34%,相对芽长为50.94%～71.03%,平均62.36%;相对根长为63.60%～91.06%,平均76.29%;相对苗鲜重为65.22%～90.58%,平均79.30%。第Ⅲ类为中耐低温材料,包含豫芝7号、赣芝S1928等44份种质(9份北方芝麻材料、26份中部材料、9份南方材料),占供试材料23.42%,其相对芽长为40.73%～59.86%,平均52.35%;相对根长为56.28%～75.18%,平均65.75%;相对苗鲜重为62.43%～83.59%,平均72.85%。第Ⅳ类为不耐低温材料,含郑芝15号、皖芝1号等50份种质,南、北、中部地区分别含有8、10、32份,占供试材料的26.60%,3个相对性状的平均值分别为44.05%、60.81%和65.61%。第Ⅴ类为极不耐低温材料,包括中芝15号、赣芝7号等47份材料,其中北方种质8份、中部种质24份、南方种质15份,占供试材料25%,相对芽长为14.46%～45.49%,平均32.57%;相对根长最小值为36.38%,最大值为66.24%,平均48.03%;相对苗鲜重为38.44%～68.51%,平均57.89%。

a和b是同一张聚类分析图,a为上半部分,b为下半部分。Ⅰ,高耐低温型材料;Ⅱ,耐低温型材料;Ⅲ,中耐低温型材料;Ⅳ,不耐低温型材料;Ⅴ,极不耐低温型材料。虚线表示欧式遗传距离10。a and b are the same cluster analysis diagram, a is the upper part, b is the lower part.Ⅰ, Highly low-temperature resistant materials; Ⅱ, Low-temperature resistant materials; Ⅲ, Intermediately low-temperature resistant materials; Ⅳ, Low-temperature intolerant materials; Ⅴ, Extremely low-temperature intolerant materials. The dotted line indicates that Euclidean distance value is 10.图4 188份芝麻种质资源芽期低温耐受性聚类分析Fig.4 Cluster analysis on cold tolerance of 188 sesame accessions at early seedling stage

表3 不同类型芝麻种质低温耐受性比较Table 3 Comparison of low temperature tolerance of different types of sesame germplasm resources

2.4 不同地理来源的芝麻种质低温耐受性比较

按地理来源对芝麻种质的低温耐受性进行比较,结果如表4和图5所示,188份芝麻种质资源中,北方种质平均隶属函数值为0.18～0.73,变异系数达0.30,无高耐低温材料,耐低温型、中耐低温型、不耐低温型和极不耐低温型材料占比分别为25%、25%、27.78%、22.22%;中部种质的平均隶属函数值为0.15～0.92,变异系数达0.35,高耐低温、耐低温材料数量在中部种质中占比达26.13%;南方种质平均隶属函数值为0.18～0.86,变异系数达0.40,56.10%的南方种质被鉴定为不耐低温和极不耐低温材料,高耐低温材料、耐低温型、中耐低温型分别占南方种质总量的2.44%、19.51%、21.95%。高耐低温材料中,中部地区材料占80%,可见中部地区芝麻种质资源低温耐受性的丰富程度高于其他地区。综上所述,中部地区部分芝麻种质低温耐受性略强于南方种质和北方种质。这可能与中部地区气候丰富多样、种质适应性强且本次供试材料中部种质占比较大有一定关系。

图5 不同类型芝麻种质资源数量与各地区资源占比率Fig.5 Numbers and proportions of different types in sesame accessions

表4 不同地理来源的芝麻材料低温耐受性比较Table 4 Comparison of low temperature tolerance of different regional sesame materials

2.5 芽期低温胁迫下不同基因型芝麻的生理响应

在芽期低温胁迫下,漯芝16号(强耐低温型)、清油河芝麻(不耐低温型)的细胞膜脂质过氧化程度均增强,芽的MDA含量与增幅皆高于根部;与对照相比,芽的MDA含量显著增加,漯芝16号根部MDA含量无显著变化,而清河油芝麻根部MDA含量显著增加(图6-A)。漯芝16号在遭遇低温时芽中H2O2含量无显著变化,而根部H2O2含量显著升高;清油河芝麻芽和根部H2O2含量均显著增加,根部增幅大于漯芝16号(图6-B)。高耐低温芝麻遭遇低温胁迫后,MDA和H2O2含量的增长幅度均小于不耐低温芝麻。

无论耐低温型材料还是低温敏感型材料,在遭遇低温时,芝麻芽的SOD、CAT活性皆增强(图6-C、图6-D),这在一定程度缓解了植物芽组织的过氧化伤害。漯芝16号在低温应激时芽和根部的SOD活性无显著变化,而清河油芝麻SOD活性在两组织中均显著增加(图6-C)。不同芝麻材料芽的CAT活性均强于根,这表明芝麻芽的活性氧清除能力更强(图6-D)。

由图6-E、图6-F、图6-G可见,两份供试材料在低温胁迫时芽和根部SS、SP、Pro含量均增加,其中,与对照相比,两份供试材料SS、SP含量均显著增加,清油河芝麻芽中Pro含量显著增加。

CK, 对照;T, 低温处理。数据以鲜质量计。柱上无相同小写字母表示同一品种同一组织差异显著(P<0.05)。CK, Control; T, Low temperature treatment. Data was detected based on fresh weight. Bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at 0.05 level.图6 低温胁迫下2个基因型芝麻种质芽、根的生理指标变化Fig.6 Physiological changes in shoot and root of two sesame genotypes under low temperature stress

芝麻低温耐受性与芽H2O2、SP、SS含量和CAT活性负相关,与根H2O2、SP、SS含量和SOD活性负相关,与其余指标正相关,其中耐低温能力与芽MDA含量、SOD活性极显著或显著正相关。低温耐受性与所有芽的生理指标增幅负相关,其中与H2O2、SP、CAT、Pro含量和SOD活性增幅呈显著或极显著负相关;而与根的Pro含量增幅正相关,与CAT活性增幅显著正相关,与根部其他生理生化指标增幅负相关,且与H2O2、SP、SS含量和SOD活性增幅的相关系数均达显著水平(表5)。

表5 芽期低温胁迫下芝麻生理生化指标与品种低温抗性的相关性Table 5 Correlation of low temperature tolerance of varieties and physiological and biochemical indexes of sesame under low temperature stress during the early seedling stage

3 讨论

3.1 温度对芝麻芽期生长的影响

温度是植物生长发育过程中的重要环境因子之一,只有在适宜温度下植物才能正常进行物质运输和能量交换[32]。低温是植物发芽期和苗期生长的主要限制因素之一,在生长早期,温度低于15 ℃会损害和延缓种子发芽,并对幼苗下胚轴和根系伸长产生负面影响,这种影响随着胁迫时间延长而加重[33-34]。花生遭受2 ℃低温胁迫后,发芽率、发芽势、芽长均表现出不同程度的下降[20]。张海娇等[35]发现,与25 ℃相比,参试玉米品种在5 ℃培养时,苗期株高、苗鲜重均受到不同程度的影响。熊英等[36]研究表明,水稻种芽进行10 ℃低温淹水处理后,露白种子发芽受抑制,出现畸形苗。芝麻的整个生育期对环境温度都极其敏感,芽期和苗期遭遇低温时,发芽率降低,幼苗生长受抑制,严重时造成死苗[37]。本实验中,芝麻在芽期遭受15 ℃低温胁迫时,幼苗生长受阻,芽和根的生长被显著抑制,苗鲜重也大幅降低,芽长降幅与芽期低温耐受性的相关性最强,这与花生、玉米芽期低温响应的研究结果相似。

3.2 芽期低温耐受性评价方法与芝麻种质资源多样性

植物在低温条件下的表型性状受多种因素影响,单一指标无法准确反映其耐低温能力,因此进行种质低温耐受性评价时,需要将各指标进行综合考虑。隶属函数分析是一种综合评定的重要方法,在植物抗低温研究中被广泛应用[20,21,38-41]。张文娥等[41]用膜透性变化、含水量动态变化和萌芽能力的平均隶属度对葡萄12个种45个株系进行抗寒性综合评价,将材料划分为高抗、中抗、不抗3种类型。王红飞等[21]以15 ℃为胁迫温度,以相对发芽率、相对发芽指数、相对胚根长度、相对鲜重等6项指标的平均隶属函数值作为评价指标,对65份黄瓜进行芽期低温耐受性评价。本实验确定了开展芝麻芽期低温胁迫鉴定的适宜温度为18 ℃,高于花生、玉米等作物的低温鉴定温度,这可能是因为芝麻嗜热,更容易受低温影响。188份芝麻种质资源中多数材料对18 ℃表现为中耐、不耐和极不耐等类型,筛选出的5份高耐低温材料(驻芝19、驻芝16、沙洋芝麻、鄂芝1号、漯芝16号)在芽期低温处理下,芽长、根长和苗鲜重3个性状的平均相对值可分别达到79.48%、92.26%、97.33%,具有高耐低温能力,这为后续芝麻耐低温育种,以及探索芝麻耐低温机理研究提供了宝贵的材料。此外,不同生长阶段遭遇的低温条件和低温应激存在差异,芽期鉴定的耐低温材料与苗期、成株期是否具有相关性,需进一步研究。

3.3 芽期低温耐受能力与地理来源分布的关系

前人研究发现,部分作物品种的低温耐受性与地理分布、海拔有一定相关性。闫蕾等[39]研究表明,北部和中部油菜芽期低温耐受性明显强于南部油菜。韩龙植等[42]研究表明,高纬度地区水稻品种芽期的低温耐受性强于低纬度地区。本研究结果表明,同一地理来源芝麻的低温耐受性具有巨大差异,特别是中部江淮地区种质,包含4份高耐低温种质,还有22份极不耐低温型种质,这可能与江淮地区地处温带与亚热带过渡地区,冷暖气团活动更为频繁有一定关系。不同地理来源芝麻种质的芽期低温耐受性具有丰富的多样性,但地区间的差异不明显,这可能与不同区域来源的供试材料数量不均衡有一定的关系。

3.4 低温胁迫对芝麻芽期生理生化的影响

在低温、干旱等逆境胁迫下,植物的呼吸速率加强,新陈代谢加速,植物体内会产生一系列的活性氧,包括超氧自由基(O2-)、H2O2和羟基自由基。这些活性氧会破坏酶的活性,扰乱膜的稳定性,损害DNA的复制和蛋白质的合成等。在逆境胁迫过程中,植物通过提高体内抗氧化酶活性,协同清除多余的活性氧,降低细胞膜膜脂的过氧化程度,提高植物的低温耐受性[43-44]。张慧君等[45]研究了火龙果幼苗在6个温度处理下的抗寒性相关生理生化指标变化,发现随着温度的降低,MDA含量升高,SOD活性不断增强,SP、Pro含量不断上升。王树刚等[46]研究表明,冬小麦经低温胁迫3 d后,功能叶和茎中SOD、POD、CAT活性均不同程度升高。本研究中,芝麻芽期低温协迫导致各组织脂质过氧化程度加深,H2O2、MDA含量增加,渗透调节系统紊乱。

4 结论

18 ℃为芝麻芽期低温耐受性鉴定评价的处理温度,188份芝麻种质中鉴定出5份高耐低温材料,芝麻芽和根对低温的生理响应基本一致,但芽中生化物质的活性和含量均高于根部,不同指标之间的变化趋势存在差异。根部细胞膜的脂质过氧化伤害程度表现较轻,渗透调节物质积累与芽相比较少,保护酶活性弱于芽。