儿童幽门螺杆菌相关性胃炎与胃黏膜闭锁蛋白关系的研究

赵燕　田飞　张丽娟　陈云庆　王彩霞

［摘要］ 目的 探討幽门螺杆菌（Hp）相关性胃炎患儿感染的Hp类型、胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率及胃黏膜炎症程度间的关系。方法 选取2018年6月—2021年12月于我院接受胃镜检查并且确诊为Hp相关性胃炎的90例患儿作为研究对象。采用免疫印迹法检测患儿血清Hp抗体表达情况，对Hp进行血清学菌株分型，并观察患儿胃黏膜病理变化；采用免疫组织化学定量法检测胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率，分析Hp菌株类型、胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率及胃黏膜炎症程度间的关系。结果 Ⅰ型菌株感染患儿胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率显著低于Ⅱ型及中间型（P<0.05），Ⅱ型与中间型比较无显著差异（P＞0.05）。不同Hp菌株感染患儿胃黏膜炎症程度有显著差异（H=18.013，P<0.01），Ⅱ型轻于Ⅰ型及中间型（P<0.05），Ⅰ型与中间型差异无统计学意义（P＞0.05）。胃黏膜轻、中、重度炎症患儿的闭锁蛋白阳性表达性率分别为80.0%、35.1%和11.6%，3种炎症程度患儿闭锁蛋白阳性表达率均有显著差异（χ²=19.655，P<0.05）。结论 Hp相关性胃炎患儿的胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率与Hp菌株类型及胃黏膜炎症程度有关，Ⅰ型菌株感染和胃黏膜重度炎症时闭锁蛋白阳性表达率最低；不同类型菌株感染所致胃黏膜炎症程度不同，Ⅱ型菌株感染所致胃黏膜炎症程度最轻。Hp抗体分型检测或可预测胃黏膜紧密连接和炎症程度，胃黏膜闭锁蛋白有望成为治疗Hp相关性胃炎的重要靶点。

［关键词］ 胃炎；幽门螺杆菌；闭锁蛋白；胃黏膜；儿童

［中图分类号］ R725.7

［文献标志码］ A

RELATIONSHIP BETWEEN HELICOBACTER PYLORI-ASSOCIATED GASTRITIS AND GASTRIC MUCOSAL OCCLUDIN IN CHILDREN＼ ZHAO Yan， TIAN Fei， ZHANG Lijuan， CHEN Yunqing， WANG Caixia （Department of Pediatrics， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ Objective To explore the relationship between Helicobacter pylori （Hp） type， positive expression rate of gastric mucosal occludin and degree of gastric mucosal inflammation in children with Hp-associated gastritis. Methods Ninety children who received gastroscopy and were diagnosed with Hp-associated gastritis in our hospital from June 2018 to December 2021 were selected as the research object. The expression of serum Hp antibody in children was measured by Western blot. The strains of Hp were serotyped. The pathological changes of gastric mucosa in children were observed. The positive expression rate of gastric mucosal occludin was determined by quantitative immunohistochemistry method. The relationship between Hp strain type， positive expression rate of gastric mucosal occludin and degree of gastric mucosal inflammation was analyzed. Results The positive expression rate of gastric mucosal occludin in children infected with type Ⅰ strain was significantly lower than that in children infected with type Ⅱ strain or intermediate type strain （P<0.05）， but there was no significant difference in the positive expression rate between children infected with type Ⅱ strain and those infected with intermediate type strain （P>0.05）. There were significant differences in the degree of gastric mucosal inflammation among children infected with different Hp strains （H=18.013，P<0.01）; the degree was significantly less severe in children infected with type Ⅱ strain than in children infected with typeⅠstrain or intermediate type strain （P<0.05）， but there was no significant difference in the degree between children infected with typeⅠstrain and those infected with intermediate type strain （P>0.05）. The positive expression rates of occludin in children with mild， moderate， and severe gastric mucosal inflammation were 80.0%， 35.1%， and 11.6%， respectively （χ²=19.655，P<0.05）. ConclusionThe positive expression rate of occludin in the gastric mucosa of children with Hp-associated gastritis is related to the type of Hp strain and the degree of gastric mucosal inflammation， and the positive expression rate of occludin is the lowest when typeⅠstrain is infected and gastric mucosal inflammation is severe. The degree of gastric mucosal inflammation caused by different types of strain infection is different， and the degree of gastric mucosal inflammation caused by type Ⅱ strain infection is the mildest. Hp antibody typing detection may predict the tight junction and inflammation degree of gastric mucosa， and occludin is expected to become an important target for the treatment of Hp-related gastritis.

［KEY WORDS］ Gastritis; Helicobacter pylori; Occludin; Gastric mucosa; Children

幽门螺杆菌（Hp）作为Ⅰ级致癌原^[1]，与慢性胃炎、消化性溃疡及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生发展密切相关，且属于胃癌重要危险因素之一^[2]。儿童是Hp的易感人群，全球约有三分之一的儿童感染Hp^[3]，且一旦被感染很少自然清除。并非所有Hp感染患儿均存在相同临床结局，其不仅与宿主及环境等因素相关，还可能与Hp菌株毒力因子类型有关^[4-5]。紧密连接蛋白在胃黏膜机械屏障中起着非常重要的作用，胃黏膜闭锁蛋白是紧密连接蛋白的重要组成部分^[6-7]。闭锁蛋白的异常表达会导致紧密连接蛋白的结构和功能紊乱^[6]，上皮细胞间通透性增加，胃黏膜屏障遭到破坏，上述过程与胃部疾病的发生发展密切相关^[8]。国内有研究探讨了Hp阳性与阴性的慢性胃炎患儿胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率差异^[9]，但关于不同Hp菌株感染及胃黏膜不同炎症程度下闭锁蛋白阳性表达率的异同，目前尚无相关研究。本研究回顾性分析我院90例Hp相关性胃炎患儿的临床资料，探讨不同Hp菌株类型及胃黏膜炎症程度与胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率间的关系，旨在为Hp相关性胃炎患儿的临床诊疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月—2021年12月于我院行胃镜检查并确诊为Hp相关性胃炎^[10-11]的患儿作为研究对象。患儿纳入标准：①年龄<14岁者；②未行Hp根除治疗者；③同期行Hp抗体分型检测者；④临床资料完整者。排除标准：①检查前2周内服用质子泵抑制剂和（或）检查前4周内服用抗生素及铋剂者；②严重心肝肾功能不全者；③有消化道手术史及消化道穿孔者。

收集所有患儿的临床资料，包括年龄、性别、血清Hp抗体分型检测结果、¹³C尿素呼气试验（¹³C-UBT）结果及胃黏膜组织病理检查结果。根据血清Hp抗体分型检测结果，将Hp分为Ⅰ型、中间型、Ⅱ型^[12-13]。胃黏膜组织病理炎症程度参照最新的指南^[11，14]分为轻、中、重度。

1.2 免疫组织化学法检测胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率

固定胃黏膜组织标本，然后脱水、石蜡包埋、切片（3～4 μm厚），室温下脱蜡、水化，多次洗涤，加入牛奶液体封闭5 min，滴加闭锁蛋白抗体（Abcam公司，滴度1∶1 000），37 ℃下孵育2 h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次2 min，再加入荧光标记的二抗（Abcam公司），37 ℃下孵育20 min，PBS洗涤，二氨基联苯胺显色，封片，在光学显微镜下观察闭锁蛋白表达情况。以PBS代替一抗作为阴性对照。闭锁蛋白的阳性表达部位是细胞膜，以呈现淡黄色-棕褐色为阳性反应细胞；免疫组化结果评定标准参照2000年TANAKA改良的定量记分法^[15]。

2 结果

2.1 Hp相关性胃炎患儿临床资料比较

共有90例患儿纳入本研究，其中男65例，女25例，平均年龄为（10.38±1.97）岁。Ⅰ型菌株感染52例，中间型菌株感染18例，Ⅱ型菌株感染20例；闭锁蛋白阳性26例，闭锁蛋白阴性64例；胃黏膜轻度炎症10例，中度炎症37例，重度炎症43例。各型感染患儿的性别、年龄无显著差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 不同Hp菌株感染类型患儿胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率比较

免疫组化结果示，Ⅱ型、中间型、Ⅰ型菌株感染患儿胃黏膜闭锁蛋白染色强度依次变浅，说明表达量逐渐减少（图1）。Ⅰ型、中间型、Ⅱ型菌株感染患儿胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率比较差异显著（χ²=19.163，P<0.001）；其中Ⅰ型患儿闭锁蛋白阳性表达率显著低于Ⅱ型及中间型（P<0.05）。见表1。

2.3 不同Hp菌株感染患儿胃黏膜炎症程度比较

不同Hp菌株感染患儿胃黏膜炎症程度有显著差异（H=18.013，P<0.01），其中Ⅱ型輕于Ⅰ型及中间型（P<0.05）。见表1。

2.4 胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率与患儿胃黏膜炎症程度的关系

胃黏膜轻、中、重度炎症患儿闭锁蛋白阳性表达率分别为80.0%、35.1%和11.6%，3种炎症程度患儿闭锁蛋白阳性表达率差异显著（χ²=19.655，P<0.05），且两两比较均有统计学差异（P<0.05）。

3 讨论

Meta分析结果显示我国儿童Hp感染率约为30.31%，且其随年龄增长呈上升趋势，并与经济卫生条件和家庭聚集性等因素相关^[16-17]。Hp是儿童慢性胃炎的重要致病因素，儿童感染Hp后可选择的抗生素少，耐药率、复发率均高^[18]，因此对于儿童Hp感染的研究显得尤为重要。越来越多的研究重视将Hp菌株进行分型。紧密连接蛋白是胃黏膜屏障细胞间连接结构中最重要的一种蛋白复合体，闭锁蛋白是紧密连接蛋白当中最具代表性的蛋白之一^[6，19]，闭锁蛋白的异常表达与多种疾病密切相关。

本研究发现，在儿童Hp相关性胃炎中，感染不同Hp菌株的患儿其胃黏膜闭锁蛋白的阳性表达率存在着显著差异，Ⅰ型菌株感染患儿的胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率低于其他两型菌株。研究表明，感染Hp可导致胃黏膜闭锁蛋白表达下降^[20-22]。本研究进一步研究显示，Hp菌株类型与胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率有关。分析其可能的原因包括Ⅰ型菌株可同时分泌细胞毒素相关蛋白A（CagA）和细胞空泡毒素A（VacA）^[12]，CagA是Hp感染引起炎症反应的重要效应蛋白^[23]，炎症作用导致胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率下降；VacA也可导致机体慢性Hp感染^[24]，还会疏松上皮细胞之间的紧密连接^[23]，同时引发炎症反应^[25]，共同导致闭锁蛋白阳性表达率下降；VacA和CagA协同通过错综复杂的网络系统导致胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率发生变化。有研究表明紧密连接蛋白的表达与胃黏膜损伤严重程度密切相关^[26]，提示对于因消化道症状就诊且¹³C-UBT结果为阳性的患儿，或许可以通过Hp血清抗体分型来预测胃黏膜受损情况，从而有针对性地进行胃镜检查，这样既能避免过度医疗导致患儿痛苦，同时也避免了因早期未予重视导致胃黏膜进一步受损，有助于制定个体化的诊疗方案。

本研究结果表明，与其他两型相比Ⅱ型菌株引起胃黏膜炎症程度较轻，与师梦等^[27]研究结果相符合。分析原因可能因为Ⅱ型菌株不能分泌VacA和CagA，而Ⅰ型菌株可以同时分泌VacA和CagA，中间型菌株则只能分泌VacA或者CagA中的任意一种^[13，23]。CagA可诱导机体分泌高水平的炎症因子IL-1和IL-8^[28-29]，IL-8可能会放大机体对Hp的炎症反应^[30]，具有强大的致炎作用；VacA可维护Hp生存的局部微环境，同时可以活化淋巴细胞和肥大细胞产生炎症因子^[25]，诱发炎症反应。本研究结果提示，不同Hp菌株类型所致胃黏膜炎症程度不同，与上述结果均提示，早期行Hp血清抗体分型检测或可初步预测胃黏膜病变程度，有望提高Hp抗体分型检测在临床中的应用价值。

胃黏膜病理检查可反映胃黏膜炎症程度，但不同炎症程度下胃黏膜屏障结构发生何种变化尚不明确。本研究结果表明胃黏膜轻、中、重度炎症患儿胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率依次下降。闭锁蛋白的异常表达将导致紧密连接的结构和功能受损，上皮细胞之间的通透性增加，各种病原体或者毒素通过紧密连接侵入机体，导致多种疾病的发生^[19]。在成人研究中，慢性胃炎患者胃黏膜闭锁蛋白的表达显著低于健康对照组^[20-21]。本研究进一步明确了在儿童中胃黏膜不同炎症程度下闭锁蛋白阳性表达率的差异。胃黏膜炎症程度越重，闭锁蛋白表达水平越低，细菌、内毒素等更易侵入黏膜下，加重炎症程度，形成恶性循环。因此，探究通过上调闭锁蛋白表达水平恢复紧密连接的完整结构及功能，可以成为今后治疗Hp相关性胃炎的重要研究方向。

综上所述，Hp相关性胃炎患儿的胃黏膜闭锁蛋白阳性表达率与Hp菌株类型及胃黏膜炎症程度有关，Hp抗体分型检测或可预测胃黏膜紧密连接和炎症程度，胃黏膜闭锁蛋白则有望成为治疗Hp相关性胃炎的重要靶点。

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准（文件号QYFYWZLL27174）。所有试验过程均遵照《人体医学研究的伦理准则》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。作者声明：赵燕、王彩霞、田飞、张丽娟、陈云庆参与了研究设计；赵燕、王彩霞参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文，且均声明不存在利益冲突。

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（本文编辑 范睿心 厉建强）