冰菜多糖提取物的抗氧化性及抑菌活性研究

杨宗芬，王敏，王贞利，王海凤，王俊斌,c,通信作者

（天津农学院 a.基础科学学院，b.农业分析测试中心，c.化学实验教学中心，天津 300392）

冰菜（Mesembryanthemum crystallinum）又称冰叶日中花、冰花，原产非洲南部，由于其茎、叶表面富含矿物质的囊状细胞，在太阳光照射下，反射光线像冰晶一样，因此得名。冰菜具有非常独特的口感和较高的营养价值，不仅富含氨基酸、抗酸化物等机能性高的物质，还含有钠、钾、胡萝卜素等矿物质[1]。而且冰菜富含松醇、芒柄醇和肌醇，肌醇可以促进脂肪代谢、预防脂肪肝和动脉硬化，减少胆固醇、防止脱发、改善湿疹等。松醇具有降低血糖的效果，有一定的药用价值[2]。冰菜中的天然植物盐是一种低钠盐，对人体的新陈代谢有促进作用，同时还可以预防糖尿病。由于这些优良特性，冰菜已成为一种极具发展潜力的新兴保健蔬菜，市场前景广阔。

多糖（Polysaccharide），即多聚糖，是由超过10个单糖分子经脱水缩合以糖苷键结合的高分子聚合化合物。植物多糖能够有效参与调节机体的免疫系统，具有降低血糖血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及抗衰老等多种药理活性[3-6]。例如在海藻中提取的多糖可以抑制癌细胞的增殖等[7]。植物多糖也是一种比较普遍的药用成分，具有重要的应用潜力和价值[8]。科学家们对芡实多糖[9]、荠菜多糖[10]、见血青多糖[11]等植物活性成分进行研究表明，这些多糖类物质具有抗病毒、抗肿瘤、抑菌、降血糖血脂和抗血栓等生理活性和免疫调节活性[12-13]。植物多糖来源广泛、提取成本较低、对机体的毒性较低等特点，近年来，越来越受到人们的重视及关注。但是，目前关于冰菜多糖的抗氧化及抑菌活性的研究还很少。

本研究以新鲜冰菜为原料，利用超声波辅助法提取多糖，对冰菜多糖提取物的抗氧化及抑菌活性进行研究，可以为冰菜中生物活性物质提取及未来进一步的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜冰菜洗净后用吸水纸吸干，50 ℃烘干至恒重，粉碎后过筛。试剂均为分析纯。仪器：Elma P120H超声仪、T6新世纪紫外可见分光光度计、其他常规分析仪器。试验菌种：枯草杆菌、大肠杆菌，由天津农学院生物化学实验室保存。

1.2 冰菜多糖的提取及含量测定

参照熊斌等[14]的方法，以吸光度为纵坐标y，葡萄糖质量浓度（mg/mL）为横坐标x，绘制葡萄糖标准曲线如图1，进行线性拟合后得到方程：y＝15.129 0x－0.001 1，R²＝0.995 6。参照文献[15-16]的方法对冰菜多糖进行提取。称取若干冰菜粉末，以1∶20的料液比加入蒸馏水，在60 ℃的条件下用超声波提取仪在功率200 W作用60 min，然后过滤离心（4 200 r/min，10 min），除去滤渣。并对提取液依次进行脱色（提取液中加入1%的活性炭，不断搅拌30 min，离心过滤，去滤渣）、脱蛋白（上清液中加入 15%的三氯乙酸，4 ℃静置过夜，离心过滤，去滤渣）、浓缩醇沉（用无水乙醇倒入脱蛋白后的上清液中至无水乙醇浓度为 80%，醇沉12 h，过滤），沉淀物50 ℃干燥至恒重。取适量提取物粉末用蒸馏水定容至100 mL，得冰菜多糖提取液。取提取液2 mL，测定方法同标准曲线，依据线性回归方程求得提取液中多糖的浓度，冰菜多糖百分含量按照下式计算：

图1 葡萄糖标准曲线

多糖含量（%）＝（C×V×D）/M×100

式中，C为待测液的质量浓度（mg/mL），V为待测液的体积（mL），D为稀释倍数，M为样品的质量（mg）。

1.3 羟基自由基清除率的测定

参考银喆等[17]的方法。将多糖溶液配制成质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的冰菜多糖提取液。依次取6.0 mmol/L FeSO4溶液、6.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、冰菜多糖提取液及6.0 mmol/L H2O2溶液各2 mL于试管中，混合均匀后在37 ℃下反应30 min，于510 nm处测定其吸光度，记为A1。用2.0 mL蒸馏水代替冰菜多糖提取液测定其吸光度，记为A0。用2.0 mL蒸馏水代替H2O2溶液测定其吸光度，记为A2。

同时以维生素C作为阳性对照，按下列公式计算羟基自由基清除率：

羟基自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）/A0]×100

1.4 DPPH自由基清除率的测定

参考文献[18]的方法。将多糖溶液配制成质量浓度分别为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的冰菜多糖提取液。在试管中依次加入冰菜多糖提取液1 mL、浓度为0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2.5 mL，避光反应30 min，在517 nm处测定其吸光度，记为A0。取2.5 mL无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，测定其吸光度，记为A1。取2.5 mL DPPH乙醇溶液与1.0 mL乙醇混合，测定其吸光度，记为A2。

同时以维生素C作为阳性对照，按下列公式计算清除率：

DPPH 清除率（%）＝[1－（A0－A1）/A2]×100

1.5 总还原能力的测定

参考文献[19]的方法，将多糖溶液配制成质量浓度分别为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的冰菜多糖提取液。在10 mL离心管中分别依次加入0.2 mol/L pH为6.6的磷酸缓冲液2.5 mL、冰菜多糖提取液1 mL、1% 铁氰化钾2.5 mL。混合均匀后在50 ℃水浴锅中反应20 min，取出后加入10%三氯乙酸2.5 mL终止反应，在离心机中5 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL于试管中，再依次加入蒸馏水2.5 mL、FeCl30.5 mL，混合均匀后静止10 min，并在700 nm处测定其吸光度。同时以维生素C作为阳性对照。

1.6 亚硝酸根离子清除率的测定

参照文献[20]的方法，将多糖溶液配制成质量浓度分别为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的冰菜多糖提取液。准确吸取5 μg/mL NaNO2溶液2 mL于25 mL的容量瓶中，加入冰菜多糖提取液1 mL，在25 ℃下放置30 min，再加入4 mg/mL 的对氨基苯磺酸溶液2 mL，混匀，静置在25 ℃下5 min，加入2 mg/mL盐酸萘乙二胺溶液1 mL ，加水至刻度。25 ℃放置15 min，并于538 nm处测定吸光度，记为A0。按上述方法测定其不加冰菜多糖提取液时NaNO2的吸光度，记为A1。按上述方法测定不加 NaNO2溶液时冰菜多糖提取液的吸光度，记为A2。

同时以维生素C作为阳性对照，按下列公式计算清除率：

亚硝酸根离子清除率（%）＝[1－（A0－A1）/A2]×100

1.7 油脂氧化抑制率的测定

采用文献[21]的测定方法，以鸡油和菜籽油作为动物油和植物油样品。称取2 g油样，加入一定量的冰菜多糖提取物，45 ℃下恒温24 h。处理过的混合油样 1 mL加入 2 mL 20%的三氯乙酸和2 mL 0.6%的硫代巴比妥酸，在沸水浴下20 min，取出冷却后加入5 mL三氯甲烷，充分混匀，离心后取上清液在532 nm下测定其吸光度，记为A1。以蒸馏水代替样品测定吸光度，记为A0。

同时以维生素C作为阳性对照，按下列公式计算抑制率：

抑制率（%）＝（A0－A1）/A0×100

1.8 抑菌活性测定

配制含量为0.25、0.50、1.0、1.5、2.5 mg/mL的冰菜多糖提取液，利用滤纸片法[22]进行抑菌试验。将定性滤纸制成6 mm圆形滤纸片，121 ℃灭菌20 min，观察冰菜多糖提取液对大肠杆菌和枯草杆菌的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法，经计算冰菜提取物中多糖百分含量为11.21%（干重）。表明在料液比1∶20、提取温度60 ℃，超声提取60 min的条件下适合提取冰菜多糖。

2.2 冰菜多糖提取物的抗氧化能力

2.2.1 冰菜多糖提取物对羟基自由基的清除作用

由图2可以看出，冰菜多糖提取物的质量浓度从0.02 mg/mL上升到0.10 mg/mL时，对羟基自由基的清除能力也随之增加，在质量浓度为 0.10 mg/mL时，清除能力为73.93%。结果表明冰菜多糖提取物对羟基自由基具有较高的清除效果，清除率与提取物质量浓度成正相关。与维生素C对照组相比，冰菜多糖提取物对羟基自由基的清除能力略低。

图2 冰菜多糖提取物对羟基自由基的清除作用

2.2.2 冰菜多糖提取物对DPPH自由基的清除作用

从图3可知，随着冰菜多糖提取物质量浓度的增加，其清除DPPH自由基的能力也随之增加，但清除能力相比维生素C对照组较弱。在质量浓度为0.10 mg/mL时，清除率达到最高，为34.75%。结果表明DPPH清除率与提取物质量浓度成正相关，说明冰菜提取物具有一定的清除DPPH自由基能力。

图3 冰菜多糖提取物对DPPH自由基的清除作用

2.2.3 冰菜多糖提取物的总还原能力

测定总还原能力时，其吸光度值越大表示还原能力越强，即抗氧化性越强。由图4可知，在0.02～0.10 mg/mL质量浓度范围内，冰菜多糖提取物总还原能力与吸光度呈线性关系，当样品质量浓度为0.10 mg/mL时，吸光度为0.265，表明冰菜多糖提取物具有一定的还原能力。结果也表明，冰菜多糖提取物的总还原能力低于维生素C。

图4 冰菜多糖提取物的总还原能力

2.2.4 冰菜多糖提取物对亚硝酸根离子的清除作用

如图5所示，冰菜多糖提取物在质量浓度为0.02～0.10 mg/mL之间时，随着质量浓度增加，其对亚硝酸根离子清除能力也逐渐增加，当提取物质量浓度为0.10 mg/mL时，亚硝酸根离子清除能力为36.73%。并且冰菜多糖提取物对亚硝酸根离子清除能力高于维生素C对照组。这表明冰菜多糖提取物对亚硝酸根离子有较强的清除能力。

图5 冰菜多糖对亚硝酸根离子的清除作用

2.3 冰菜多糖提取物对油脂氧化的抑制效果

由图6可知，随着冰菜多糖提取物添加量的不断增加，其对氧化产物丙二醛的抑制率也逐步增大，但都略低于维生素C的抑制率。当多糖提取物的添加量在 1.50%时，对植物油氧化的抑制率为71.81%，对动物油氧化的抑制率为57.64%。研究结果表明，冰菜多糖提取物对植物油和动物油的氧化都有一定程度的抑制作用，对植物油的氧化抑制效果强于对动物油的氧化抑制效果。

图6 冰菜多糖提取物对油脂的抗氧化效果

2.4 冰菜多糖提取物的抑菌能力

冰菜多糖提取物对大肠杆菌、枯草杆菌的抑菌试验效果见表1。结果表明，在所测试的范围内，冰菜多糖提取物对两种菌均有不同程度的抑制作用，对枯草杆菌的抑制作用更强，且随质量浓度增大抑制效果增强。在质量浓度低于1.00 mg/mL时，提取物的抑菌效果不明显或没有抑菌效果。在2.00 mg/mL最大质量浓度下，对枯草杆菌、大肠杆菌的抑菌圈直径分别为（12.10±0.30）和（10.40±0.35）mm。

表1 冰菜多糖提取物的抑菌圈直径 mm

3 讨论与结论

冰菜作为一种新型特色蔬菜，具有较高的营养价值和经济价值。国内外一些研究者对冰菜提取物中的活性成分进行的研究表明：冰菜具有良好的抗氧化活性，能有效清除体内自由基，抑制脂质过氧化及保护机体生物大分子[23-24]。大量研究表明，植物多糖具有增强免疫力、抗肿瘤、抑菌、抗氧化等作用[25]。以往文献报道，羊栖菜、黄花菜、莼菜等植物中多糖能有效清除DPPH、超氧阴离子和羟基自由基[26-28]。本研究利用超声波辅助法对冰菜多糖进行提取和测定，研究冰菜多糖提取物的抗氧化和抑菌活性。限于试验时间和条件，未对冰菜多糖提取物进行纯化，获得的只是粗提物，因此多糖含量较低。未来进一步研究可以采用大孔树脂法、溶剂萃取法和沉淀法等方法，提高冰菜提取物中的多糖纯度。

本试验采用DPPH自由基和羟基自由基清除率来评价冰菜多糖提取物的抗氧化活性，结果表明，冰菜多糖提取物具有较强清除自由基的能力。同时，冰菜多糖提取物也具有很强的清除亚硝酸离子的能力和一定的总还原力。在一定质量浓度范围内，冰菜多糖提取物对油脂氧化的抑制能力与浓度成正相关。此外，冰菜多糖提取物对细菌呈现出不同程度的抑制活性，并且对革兰氏阳性菌（枯草杆菌）的抑菌作用大于革兰氏阴性菌（大肠杆菌）。本研究结果表明，冰菜多糖提取物具有一定的抗氧化及抑菌活性，为人们进一步认识冰菜的营养价值提供了参考依据。