细胞凋亡在肝纤维化发生、发展中的作用研究进展

牛丽娜 窦婧 李栋栋 刘云霄 王晓忠

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是由多种原因包括炎症反应、持续性病毒感染、酒精性或药物毒性等引起的慢性肝损害所致的病理改变,是肝内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积的结果[1]。若肝纤维化发生后得不到及时治疗,可导致肝硬化、肝衰竭甚至肝癌。据统计,全球每年超过100万人死于肝纤维化导致的终末期肝病,该病严重威胁着人们的身体健康[2]。细胞死亡是生物学中的一种普遍生命现象,在肝纤维化的发生、发展中起着重要作用。凋亡是细胞死亡的一种方式,本文主要综述肝脏内各种细胞凋亡在肝纤维化发生、发展中的作用[6]。

一、细胞凋亡的途径

1972年,Kerr、Wyllie和Currie首次提出了凋亡(apoptosis)一词,它的形态学特征即细胞收缩、细胞膜发泡脱落、核染色质固缩进而碎裂,最终凋亡细胞分解成膜结合凋亡小体[3]。这一形态上的变化是一个协调的、通常是能量依赖性的过程,涉及一组半胱天冬酶的激活,以及将起始刺激与细胞最终死亡联系起来的复杂级联事件。低氧、辐射、热和细胞毒性等刺激均可诱导细胞凋亡[2,3]。迄今为止的研究表明,在肝损伤中有两种主要的细胞凋亡途径:外源性途径(死亡受体途径)和内源性途径(线粒体途径)。

(一)细胞凋亡的外源性途径(死亡受体途径) 细胞凋亡的外源性基础是死亡受体参与的信号转导。Fas受体-配体途径介导的细胞凋亡是迄今为止研究最为清晰的一种途径。Fas在肝脏各种细胞中表达,其配体FasL以膜结合形式在体内存在。FasL与细胞表面的Fas结合后,启动FasL的寡聚化和基于Fas的胞内死亡域与Fas相关死亡结构域(FADD)相互作用的基础上进行信号转导[3,4]。传递凋亡信号的FADD负责招募procaspase-8,形成Fas-FasL-FADD-procaspase-8死亡诱导信号复合物,该复合物导致procaspase-8裂解为有催化活性的形式并且激活下游效应因子caspase-3和caspase-7,从而引起细胞发生凋亡[2]。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其受体介导的细胞凋亡:TRAIL的受体为死亡受体4(DR4)与死亡受体5(DR5)[5,6]。当TRAIL与DR4或DR5结合后导致DR4或DR5三聚化并组成死亡诱导信号复合物,继而激活caspase-8,caspase-8直接激活caspase-3、caspase-6和caspase-7启动细胞凋亡。

另一种死亡受体途径为TNFR1信号转导途径介导的细胞凋亡[4-5]:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与其同源受体TNF-R1结合参与细胞凋亡信号的转导。一般认为TNFR可与FADD结合,进而通过caspase-8途径启动细胞凋亡;TNFR也可以激活JNK[6],随即JNK激活下游的促凋亡蛋白Bαx并且抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,进而诱导凋亡。

(二)细胞凋亡的内源性途径(线粒体途径) 线粒体是存在于大多数细胞中,为细胞的各种生命活动提供能量。在线粒体中含有一部分促凋亡蛋白,如促凋亡诱导因子AIF、核酸内切酶G、Smac/DIABLO、细胞色素c等[7-9]。当受到凋亡刺激因子作用时,如癌基因的活化DNA损伤、细胞缺氧[19]、细胞生长因子缺失、病毒等刺激激活位于细胞质中的Bαx,被激活的Bαx随即移位到线粒体上[7,810],与位于线粒体外膜的Bak相结合,导致线粒体的通透性增强引起细胞色素c被释放。细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和三磷酸腺苷(ATP)结合激活procaspase-9继而活化caspase-3和caspase-7,诱发凋亡[11,12]。

二、细胞凋亡与肝纤维化

细胞凋亡由多种重要的凋亡调控因子如Bcl-2家族和抑癌基因p53参与调控。Bcl-2家族中的促凋亡蛋白包括BH123蛋白和BH3-only蛋白,其中BH123蛋白中的Bax和Bak以及BH3-only蛋白中的Bad、Bim、Puma等在细胞凋亡中死亡受体途径与线粒体途径均能激活caspase-3,诱导细胞凋亡。肝纤维化是慢性肝损伤的结果,涉及多种细胞与多个环节[13-15],可引起成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞等产生胶原蛋白和细胞外基质(ECM)蛋白的异常沉积。近年来,多项研究表明,肝脏中各种细胞凋亡与肝纤维化密切相关。一般认为,肝星状细胞(HSC)的活化是导致肝纤维化的主要原因。因此,诱导HSC凋亡和抑制HSC激活,是抗纤维化治疗的重要手段。有研究已表明,通过(信号转导与转录激活因子1)STAT1激活可直接诱导HSC凋亡,从而改善纤维化的进展[16,17]。除了HSC,肝脏胶原代谢的细胞学基础还有肝细胞、巨噬细胞等,这些细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMP)及其抑制物(TIMP)[17]在肝纤维化的发生和发展过程中至关重要:MMP是可降解ECM的重要蛋白质分解酶,而TIMP是一组具有抑制MMP功能的活性多肽,从而抑制ECM的降解[28],引起肝纤维化。

三、肝脏内各种细胞凋亡与肝纤维化的关系

在肝脏稳态的情况下,细胞凋亡经过精确地调控,细胞发生凋亡的数量小,所以一般不会引发肝组织损伤。而在病理作用影响下,如急性肝炎表现出的凋亡超过了肝脏的再生能力或者慢性肝脏炎症下显现出的炎症级联反应的激活,最终将导致肝纤维化。肝细胞、肝星状细胞凋亡对肝纤维化有重要影响。

(一)肝细胞凋亡对肝纤维化的影响 肝细胞约占肝脏细胞总量的80%,是肝脏中最主要的实质细胞。肝细胞凋亡可刺激基质沉积诱导肝纤维化[29]。在肝细胞凋亡的过程中,凋亡小体由细胞周期蛋白c(CCty-c)、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)、caspase-9和ATP/dATP形成,形成凋亡小体后,半胱天冬酶(caspase)被激活,导致caspase介导的级联反应,最终发生肝细胞凋亡[18-19]。

肝细胞凋亡受Fas/FasL信号通路调控从而影响肝纤维化:Fas/FasL信号通路介导的细胞凋亡在肝纤维化的发生和发展中起重要作用。Fas与其配体FasL结合后触发凋亡信号。在慢性乙型病毒性肝炎与慢性丙型病毒性肝炎患者中,有12%～65%的肝细胞发生凋亡与Fas/FasL途径相关,通过激活Fas死亡受体,细胞凋亡可引发促纤维化反应。诱骗受体3(DcR3)是肿瘤坏死因子(TNF)家族的新成员,可与Fas 配体结合,通过 Fas/FasL 信号通路介导的细胞凋亡。金珍婧教授团队[20]前期研究发现肝细胞经过DcR3处理后,Fas、FasL的表达被抑制进而减少了肝细胞的凋亡;该团队通过进一步研究发现,使用DcR3可明显抑制肝纤维化大鼠肝组织中Fas、FasL的mRNA和蛋白质表达水平;同时发现DcR3能与Fas竞争性结合配体FasL,导致 FasL与Fas结合降低,进而抑制了Fas/FasL信号通路诱导肝细胞凋亡。综上研究结果表明,DcR3可缓解肝纤维化的作用机制之一。同时,Siwei Tan等发现Fas/FasL信号通路通过调节自噬信号和NF-κB p65磷酸化促进PUMA介导的肝细胞凋亡,而抑制自噬或PUMA缺乏则减弱Fas/FasL调节的肝细胞凋亡和肝纤维化[21]。

肝细胞凋亡受PI3K/Akt信号通路调控从而影响肝纤维化:PI3K是胞内的信号转导分子,当受到外界刺激后被激活,活化的PI3K刺激Akt与膜结合,在磷脂酰肌醇依赖蛋白的作用下Akt被活化为p-Akt,随后激活Bcl-2相关死亡启动子、核因子κB( NF-κB)等下游相关靶蛋白从而调节细胞凋亡。刘伟教授团队[22]揭示了PI3K-Akt抑制剂诱导死亡受体介导的肝细胞凋亡与肝损伤机制发现PI3K-Akt抑制剂促进了小鼠肝细胞凋亡,同时首次证明了PI3K-Akt抑制剂类药物可以促进死亡受体介导的肝细胞凋亡。另外,Li Yang等[23]研究发现Tβ4和lincRNA-p21的表达均与肝纤维化密切相关,Tβ4可通过抑制PI3K-Akt-NF-κB通路来抑制lincRNA-p21过表达诱导的肝细胞凋亡和纤维化。

另外,参与肝细胞凋亡的的手段还有发现的一种减少肝损伤的方法:抑制刺激肝细胞凋亡的应激信号即属于MAPK途径的凋亡信号调节激酶(ASK1),它参与肝细胞凋亡、炎症和纤维化。在该项研究中结果发现选择ASK1抑制剂Selonsertib可改善了NASH小鼠模型导致的肝纤维化[24]。

(二)肝星状细胞凋亡对肝纤维化的影响 在正常的肝组织中,肝星状细胞约占肝实质细胞的5%,是维生素A的主要存储部位。但是在慢性炎症影响的情况下,肝星状细胞促进细胞外基质(ECM)的沉积,导致肝纤维化[24]。凋亡在HSC的激活中起着十分重要的作用,影响着肝纤维化的进展[22]。HSC凋亡的中心特征是细胞核DNA的降解和修饰,发生凋亡的细胞中DNA和胞苷磷酸鸟苷(CpG)使HSC中的转化生长因子-β1(TGF-β1)和胶原蛋白1(collagen-1)上调加重肝纤维化。活化的HSC主要通过细胞凋亡途径减少:HSC胞内的caspase可通过胞外的死亡信号激活导致HSC发生凋亡,也可经过线粒体膜通透性转运孔(MPT)的开放导致HSC凋亡。

肝星状细胞凋亡受Fas/FasL信号通路调控从而影响肝纤维化:早在1998年,Gong等就已经发现HSC的凋亡反应与可溶性FasL成剂量依赖关系,同时证明了HSC通过Fas受体途径发生凋亡。因此,我们可利用该信号通路调控细胞凋亡逆转肝纤维化。近年有研究结果表明:水飞蓟宾可以增加Fas与caspase-8的表达,通过Fas/FasL信号通路诱导HSC发生凋亡[25]。我国名老中医林沛湘所创用于治疗肝纤维化的经验方壮肝逐瘀煎,已经通过实验验证了该方可通过下调Fas、FasL来抑制HSC凋亡[26]。另一项研究也表明[29],HSC经索拉非尼干预后,Fas、FasL和caspase-3表达水平上调,并降低了Bcl-2与Bαx的比率,诱导了HSC凋亡。

肝星状细胞凋亡受PI3K/Akt信号通路调控从而影响肝纤维化:PI3K/Akt信号通路在肝星状细胞凋亡的调节过程中至关重要[27]。在一项研究中发现,X射线照射HSC后,激活PI3K/Akt通路可使HSC活化水平增高,同时凋亡率也有所升高;而抑制PI3K/Akt信号通路后,HSC活化水平降低,缓解了肝纤维化[28]。在肝纤维化过程中,PI3K/Akt信号通路常处于活化状态。纤维化改善可以用药物通过PI3K/Akt信号通路诱导HSC凋亡来治疗,索拉非尼是一种多效激酶抑制剂,可以抑制人及大鼠肝脏中的HSC活性,促进HSC凋亡。Yan Wang等[29]发现索拉非尼无论在体外或者在体内都能够抑制Akt的磷酸化,阻断PI3K/Akt/p70S6K信号通路可诱导HSC凋亡并减轻肝纤维化。Qin Chen等[30]证明了双氢青蒿素通过阻断PI3K/AKT信号通路可诱导HSC凋亡,同时该团队进行了PI3K特异性抑制剂LY294002模拟了双氢青蒿素的促凋亡作用的过程,发现双氢青蒿素是预防和治疗肝纤维化突出,值得进一步深入探讨。赵铁建团队[31]通过使用HSC-T6细胞探讨黄醇对肝星状细胞PI3 K/Akt/mTOR信号通路的影响,证明了姜黄酚通过抑制该途径诱导HSC凋亡,从而达到抗肝纤维化的目的。

综上,细胞凋亡是一个非常复杂的过程,是由基因控制的细胞自主的有序的死亡,具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。肝脏中的肝细胞、肝星状细胞等异常凋亡在肝纤维化的发生、发展过程中扮演着重要作用,故抑制或诱导肝脏中的细胞凋亡为抗肝纤维化提供了新的思路。目前研究最为透彻的是Fas/FasL信号通路以及PI3K/Akt信号通路诱导的细胞凋亡。尽管在抗纤维化的斗争中细胞凋亡的研究取得了一定的进展,但是对细胞凋亡的调控以及分子机制仍有待进一步探讨。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。