巨噬细胞表型转换在肝纤维化进展及逆转中的作用

王晓凡 丛敏 贾继东

慢性肝病目前已成为世界范围内关注的重要公共卫生问题。全球疾病负担(GBD)数据库对1990年—2019年204个国家和地区的流行病学最新评估显示,尽管肝硬化发病率大幅下降,但在50～74岁的人群中,肝硬化仍然是十大疾病负担之一[1]。全球每年约有200万人死于肝病,我国肝硬化死亡人数约占全球肝硬化死亡人数的11%[2]。当病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝损伤、非酒精性脂肪性肝病等肝毒性损伤或原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)和胆道闭锁等胆汁淤积性损伤发生后,可引起肝脏慢性炎症,进而导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌[3]。既往研究认为,肝星状细胞的转分化(或“激活”)是分泌基质蛋白的肌成纤维细胞的主要细胞来源,是肝纤维化形成的主要驱动力[4]。近年来随着对肝纤维化领域的深入研究,肝脏巨噬细胞的异质性和可塑性逐渐明晰,它不仅参与肝纤维化进展,而且在肝纤维化逆转期也发挥重要作用[5,6],已成为研究者关注的热点。

一、肝脏巨噬细胞的组成和来源

肝脏参与许多重要的生理过程,包括新陈代谢、解毒和免疫[7]。同时,肝脏也是体内所有实体器官中巨噬细胞比例最高的器官[8]。巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞,在生物体的发育、损伤修复以及对病原体的免疫反应中均发挥重要作用[9]。肝脏中的巨噬细胞主要由两部分组成,一部分为组织驻留巨噬细胞(也称为库普弗细胞),另一部分为浸润性巨噬细胞,包括骨髓/单核细胞来源的巨噬细胞、腹膜巨噬细胞和脾巨噬细胞。库普弗细胞主要来源于胎儿时期卵黄囊衍生的红髓祖细胞,这些红髓祖细胞在胚胎第8.5天时发育,在胚胎第10.5天之前迁移并定植到新生胎儿的肝脏,产生胎儿红细胞、巨噬细胞、粒细胞和单核细胞。它们不由造血干细胞补充,而是通过胎儿来源细胞的自我更新来维持[10]。小鼠库普弗细胞具有F4/80、CD11b、CD68和C型凝集素结构域家族4成员F(CLEC4F)的表面表型[11]。其中CLEC4F被认为是库普弗细胞的特异性表面标志物[12]。根据CD11b和CD68在细胞表面表达的高低,库普弗细胞可分为具有吞噬活性的CD68+亚群和具有产生细胞因子能力的CD11b+亚群[13]。此外,小鼠库普弗细胞还表达多种Toll样受体(TLR),如TLR4(清道夫受体)和TLR9(补体受体),通过诱导调节性T(Treg)细胞功能维持肝脏耐受[14]。目前对于人类库普弗细胞特性的研究不如小鼠库普弗细胞深入,大多数人类研究没有仔细区分库普弗细胞和单核细胞来源的细胞。最常用的人类库普弗细胞标记物是CD14和CD68[8]。在浸润性巨噬细胞中,骨髓来源的单核巨噬细胞发挥主要作用,它在库普弗细胞和肝星状细胞激活后被募集到肝脏,参与肝巨噬细胞耗竭后补充和再生,在肝脏的病理状态中具有重要地位[6]。在小鼠体内表现为CD11b+Ly6C+细胞,并且表达多种趋化因子受体,如CC-趋化因子受体2(CCR2)、CCR5和CX3CR1[15]。根据单核细胞Ly6C的表达水平,小鼠外周血单核细胞可进一步分为Ly6Chi和Ly6Clo。Ly6Chi单核细胞被认为是参与急性炎症的促炎细胞,而Ly6Clo单核细胞负责组织修复[16]。人单核细胞亚群的分类集中在CD14(脂多糖(LPS)受体)和CD16 (FCγ受体III)的表达上。基于CD14与CD16表达的高低,其主要分为CD14++CD16-(经典型),CD14++CD16+(中间型)和CD14+CD16++(非经典型)三个亚群[17]。目前对于这三种亚群分泌的主要细胞因子的报道尚不完全统一,有待进一步研究[18]。

二、巨噬细胞的极化表型和相关分子机制

(一)巨噬细胞的极化表型 巨噬细胞极化是其在特定组织中对所处的微环境刺激和信号进行功能反应的过程[19]。研究认为,巨噬细胞的极化表型可分为经典活化的促炎表型M1和替代活化的抗炎表型M2,M2型巨噬细胞又可进一步分为M2a、M2b、M2c和M2d四种亚型[20]。M1与M2的极化源于精氨酸代谢的两条拮抗途径:精氨酸通过诱导型一氧化氮合酶(iNOS)途径产生瓜氨酸和一氧化氮(NO),进而促进巨噬细胞向M1型极化;精氨酸还可以通过精氨酸酶(Arg1)途径产生尿素和鸟氨酸,进而促进巨噬细胞向M2型极化[21]。LPS和干扰素-γ(IFN-γ)主要诱导巨噬细胞发生M1极化,其肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)和iNOS等促炎细胞因子基因的表达显著上调。M1型巨噬细胞主要功能为细菌清除,抗病毒活性和促炎细胞因子(如TNF,IL-1β,IL-12,活性氧)的释放。M2型巨噬细胞促进机体对寄生虫感染的防御,参与组织重塑和分泌免疫调节介质(如IL-10,TGF-β,IL-4,IL-13等)[22]。M2a由IL-4或IL-13诱导,它可以增强巨噬细胞内吞活性、促进细胞生长和组织修复;当暴露于toll样受体(TLRs)或白介素1受体(IL-1R)的配体时,巨噬细胞被诱导为M2b,其可促进Th2分化参与调节免疫功能;而在IL-10、TGF-β和糖皮质激素的诱导下巨噬细胞转变为M2c,可吞噬凋亡细胞并抑制炎症反应;M2d巨噬细胞则由TLR拮抗剂诱导,介导IL-10和血管内皮生长因子(VEGF)的释放,促进血管生成和肿瘤进展[20]。狭义的M2型巨噬细胞主要指M2a。近年来,单细胞RNA测序和空间转录组学技术的发展进一步揭示了之前无法识别的巨噬细胞激活状态,扩大了其极化表型谱,远超简单的M1/M2二分法。

(二)巨噬细胞极化的分子机制

1.NF-κB信号通路:NF-κB通路是一条经典的促炎信号通路,可促进巨噬细胞M1极化。有研究发现,槲皮素可降低损伤后肾脏中 NF-κB p65 和干扰素调节因子5(IRF5)活性,进而抑制巨噬细胞向M1极化改善肾损伤和纤维化[23]。此外,巨噬细胞是与白塞病(BD)发病相关的重要先天免疫细胞,用BD血清刺激巨噬细胞后,通过NF-κB信号诱导巨噬细胞向M1极化,促进BD炎症反应。M1极化的巨噬细胞可能是BD的潜在治疗靶点[24]。

2.Notch信号通路:Notch蛋白存在于细胞表面,Notch信号通路在进化中高度保守。广泛参与细胞增殖、分化和凋亡的调节。在肝脏中,它可以调节肝脏血管、胆管和免疫细胞发育[25]。急性胰腺炎(AP)是一种以腺泡细胞死亡和炎症为特征的急性炎症性疾病。有研究发现,高血糖在 AP 后诱导过度的 Notch 信号传导,并通过促进胰腺巨噬细胞向 M1 表型极化而进一步加重 AP。Notch信号通路可能是预防和治疗AP的潜在靶点[26]。此外还有研究探究了Notch信号通路在糖尿病肾病中的作用。糖尿病肾病中常伴有M1型巨噬细胞的浸润。Notch1激活的增加进一步增强了NF-κB通路的活性及其核易位,导致下游炎症介质产生增加[27]。由此可见,Notch信号通路主要诱导巨噬细胞向M1极化。

3.TGF-β信号通路:多项研究指出TGF-β信号通路在促进M2巨噬细胞极化中的作用。例如,在脑出血小鼠模型中,重组CC趋化因子配体17(rCCL17)募集调节性T细胞,通过TGFβ/TGFβR/Smad2/3通路促进M2小胶质细胞/巨噬细胞极化[28]。在体外,间充质干细胞分泌的TGF-β可通过旁分泌的形式使LPS刺激的巨噬细胞向M2样表型极化,减少炎症反应,并通过Akt/FoxO1途径提高吞噬能力,为脓毒症提供潜在的治疗策略[29]。

4.PPARγ信号通路:过氧化物酶体增殖物受体γ(PPARγ)在脂代谢、炎症和免疫反应等生物学过程中发挥重要作用,其在IL-4刺激的巨噬细胞中表达明显增加。因此,PPARγ信号通路主要介导巨噬细胞的M2极化。有研究发现,巨噬细胞特异性PPARγ敲除小鼠在高脂饮食处理后,其M2型巨噬细胞减少且更容易发生胰岛素抵抗[30]。另外,还有研究指出,在实验性急性肺损伤(ALI)小鼠模型中,maresin1(MaR1)作为二十二碳六烯酸(DHA)通过代谢酶催化而成的促炎症消退介质,可以通过激活PPARγ促进M2巨噬细胞极化,并缓解LPS诱导的ALI[31]。

5.PI3K/Akt信号通路:PI3K/Akt通路调节巨噬细胞的存活、迁移和增殖,也参与巨噬细胞对不同代谢和炎症信号的反应。该通路的激活对于限制TLR刺激巨噬细胞中的促炎反应至关重要,被认为是TLR和NF-κB信号传导的负调节因子,主要介导M2型巨噬细胞极化[32]。有研究指出,持续性慢性炎症是糖尿病伤口愈合受损的主要致病因素,胰岛素通过激活 Akt-Rac1信号通路来抑制高糖诱导的 p38、NF-κB 和 STAT1 转录活性的激活,进而诱导巨噬细胞表型从促炎(M1)向抗炎(M2)转变,促进糖尿病伤口愈合[33]。在肿瘤研究中,M2型肿瘤相关巨噬细胞通过分泌血管内皮生长因子参与血管生成,进而促进肿瘤发展。有研究表明,抗肿瘤药物雷公藤内酯+顺铂联合疗法可以通过抑制卵巢癌小鼠M2型肿瘤相关巨噬细胞极化,显著降低肿瘤负荷,延长裸鼠寿命。其机制可能与PI3K/Akt/NF-κB信号通路的抑制有关[34]。

6.STATs信号通路:STATs被认为是M1和M2巨噬细胞极化的关键因素。其中STAT1与Th1免疫应答中的M1巨噬细胞极化有关,而STAT6与Th2细胞介导的M2巨噬细胞的激活有关。一项研究指出,RNA结合基序4(RBM4)可通过抑制STAT1 活化来抑制糖酵解,进而抑制IFN-γ 诱导的 M1型巨噬细胞极化[35]。而另外一项研究则通过IL-4增加JAK1和STAT6表达及磷酸化水平,促进M2型小胶质细胞/巨噬细胞极化以缓解小鼠脑出血后的神经损伤[36]。

7.MicroRNA:MicroRNA(miRNA)是大小为21至23个核苷酸的非编码小分子RNA,在转录后水平调节基因的表达[37]。目前已有多项研究指出miRNA在巨噬细胞极化中的调控作用。根据miRNA作用机制不同,可以影响巨噬细胞向不同方向极化。例如,在一项研究中,用LPS和IFNγ刺激的RAW264.7细胞,干扰素调节因子1 (IRF1)的表达显著升高,而miR-130b-3p通过抑制IRF1并降低其下游炎症因子的水平进而抑制M1巨噬细胞极化[38]。在另外一项研究中,人脐带间充质干细胞来源的miR-146a-5p可能通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF6)/STAT1通路,促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转换,且转染miR-146a-5p的人脐带间充质肝细胞可增强糖尿病肾病大鼠的肾功能[39]。

三、巨噬细胞在肝纤维化进展中的作用

肝纤维化是各种病因导致的肝内结缔组织异常增殖的病理结果,其本质是肝脏对各种慢性损伤的过度修复反应[40]。库普弗细胞在肝纤维化的早期即发挥作用,它们通过感知肝脏稳态的破坏,进而表达CCL2和CCL5等趋化因子,从循环血液中招募单核细胞到受损肝脏,随后这些单核细胞分化为肝脏中单核细胞来源的巨噬细胞[41]。巨噬细胞可以通过分泌TGF-β等细胞因子直接激活肝星状细胞(HSC),也可以通过IL-1β和TNFα等促进肝星状细胞存活,从而促进肝纤维化进程[42,43]。与此同时,活化的HSC通过MyD88信号通路分泌趋化因子CXCL10,经与其配体CXCR3作用后诱导M1型巨噬细胞极化[44]。有研究指出,卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)在人和小鼠纤维化肝脏巨噬细胞中的表达均显著升高。巨噬细胞FSTL1通过其胞内丙酮酸激酶M2(PKM2)重编程功能,诱导M1型巨噬细胞极化和炎症,促进肝纤维化的进展[45]。此外,还有研究表明,C-C趋化因子配体3(CCL3)水平在高脂饮食小鼠肝组织M1型巨噬细胞中显著升高,CCL3基因敲除可减少巨噬细胞M1极化同时增加M2极化的比例,进而减轻高脂饮食小鼠肝组织的脂变、炎症和纤维化水平[46]。NASH小鼠的肝脏中,半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B(CatB)表达增加。研究发现,CatB缺乏可以促进M2巨噬细胞极化,降低肝脏TGF-β1信号传导和纤维化[47]。尽管在这项研究中M2型巨噬细胞极化似乎在肝纤维化方面发挥保护作用,但也有研究发现,NAFLD患者和小鼠在向NASH以及肝纤维化进展过程中,巨噬细胞向M2型极化,其通过分泌前列腺素E2 (PGE2)并与表达在HSC表面的相应受体EP4结合,促进HSC自噬,从而促进HSC活化、细胞外基质沉积和肝纤维化[48]。此外,在砷中毒时,miR-21通过诱导巨噬细胞发生M2极化,进而激活星状细胞,引起肝纤维化[49]。在慢性丙型肝炎感染时,丙型肝炎病毒诱导巨噬细胞发生M2极化,M2型巨噬细胞通过活化星状细胞引起肝纤维化[50]。由此可见,M1型巨噬细胞具有与促炎特性相关的促纤维化能力,M2型巨噬细胞在肝纤维化中的作用尚不明确,尽管其具有抗炎作用,但其也可以分泌TGFβ参与HSC的激活,因此有待进一步研究。

在浸润性巨噬细胞中,在肝纤维化进展阶段发挥主要作用的巨噬细胞亚群是Ly6c细胞亚群(Ly6chi)。在CCl4诱导小鼠急性和慢性肝损伤后,趋化因子及其受体介导Ly6chi单核细胞向肝脏的募集,这些募集的单核细胞在肝内进一步分化为产生iNOS的巨噬细胞,发挥促炎和促纤维化作用[51]。mNOX-E36是一种单核细胞趋化蛋白1(MCP1)的拮抗剂,当用CCl4和MCD饮食诱导小鼠发生肝损伤时,其主要通过抑制Ly6Chi血液单核细胞向肝脏的迁移进而改善肝纤维化[52]。此外,还有研究发现,富含三萜类化合物的苦瓜叶提取物可以减少肝内炎症性Ly6C+单核细胞浸润,通过抑制肝脏中的炎性细胞因子分泌和α-SMA表达来改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化[53]。

四、巨噬细胞在肝纤维化逆转中的作用

巨噬细胞不仅促进了肝纤维化的进展,在肝纤维化逆转过程中,它还可以促进HSC的凋亡和ECM的降解。如前所述,肝脏中浸润的单核细胞分为两个主要亚群,促炎型的Ly6Chi和促进组织修复的Ly6Clo。从Ly6Chi单核细胞到Ly6Clo单核细胞的表型转换是肝纤维化消退的重要途径。Ly6Clo高表达基质金属蛋白酶(MMP),对于逆转肝纤维化至关重要[54]。有研究发现,在肝纤维化逆转阶段,CD11bhiF4/80intLy6Clo巨噬细胞亚群在肝纤维化消退时最为丰富,提示其可能为主要的基质金属蛋白酶(MMP)表达亚群[55]。此外,也有研究表明,利用巨噬细胞疗法将骨髓来源的巨噬细胞经体外诱导极化为M1型巨噬细胞输注给小鼠后,可以通过调节小鼠的免疫微环境来募集更多的内源性巨噬细胞,且呈现Ly6Clo巨噬细胞表型,即高表达MMP以促进纤维降解[56]。在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中,移植的骨髓间充质干细胞可以通过分泌细胞因子IL-4和IL-10的途径,显著促进巨噬细胞从促纤维化的Ly6Chi亚群到恢复性Ly6Clo亚群的表型转换,同时通过自身凋亡促进Ly6Clo亚群的功能,减轻肝纤维化[57]。同样在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中,通过脾切除可以促进巨噬细胞中ERK1/2的磷酸化,进而促使募集到肝脏的巨噬细胞向Ly6Clo型转化,缓解肝脏炎症和纤维化[58]。

五、巨噬细胞在肝纤维化治疗中的应用及展望

巨噬细胞作为一种吞噬细胞,不仅能够清除机体中衰老或凋亡的细胞,而且这些活化的巨噬细胞还能产生抗菌介质,如活性氧、氮和蛋白质酶,有助于杀死入侵的病原体,从而恢复组织稳态[59]。肝巨噬细胞在正常组织稳态中发挥重要作用,在肝损伤时也是最先识别损伤部位、引起炎症反应的细胞,与此同时,肝巨噬细胞还具有促进和抑制肝脏疾病进展的双重功能。近年来,靶向巨噬细胞治疗肝脏疾病逐渐成为研究的热点。目前大多数基于靶向巨噬细胞疗法的研究都处于临床前阶段,仅有少部分进入了临床研究。根据作用机制的不同,主要分为三大类[60]:(1)抑制库普弗细胞激活。纤维细胞生长因子21(FGF21)的类似物作为2型糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗药物,目前正在临床研发中。有研究发现,FGF21分别通过内分泌和自分泌信号传导来阻断肝脂质的流入和积累,从而防止库普弗细胞活化并降低脂质和疤痕相关巨噬细胞的存在以抑制纤维化[61]。(2)抑制单核来源的巨噬细胞向肝脏募集。炎性单核细胞主要趋化因子通路包括CCL2-CCR2、CCL1-CCR8、CCL5-CCR1/CCR5和CXCL10-CXCR3等[15]。可以通过针对趋化因子或受体的单克隆抗体、阻止趋化因子结合的受体拮抗剂等干扰趋化因子信号传导,进而抑制单核细胞向肝脏募集。西尼昔洛韦(cenicriviroc,CVC),作为CCR2/CCR5的双重拮抗剂,目前已有临床研究证实CVC可以改善非酒精性脂肪性肝炎患者的肝纤维化[62]。(3)调控巨噬细胞极化。例如可以通过增强对恢复性巨噬细胞的分化或抑制炎症性巨噬细胞极化,进行抗肝纤维化治疗。目前一项英国临床试验进行了输注自体巨噬细胞治疗肝硬化的安全性评估,此项研究中使用的巨噬细胞来源于患者的外周血单核细胞,经体外诱导为组织修复型巨噬细胞后进行自体输注[63]。

尽管现在对于巨噬细胞在肝病中的研究已取得一定进展,但从实验动物研究到人类疾病临床研究的转化尚存在很多障碍,例如人类和动物模型中巨噬细胞表型的差异导致动物模型中研究的治疗方法难以应用于人类;人类肝脏中肝巨噬细胞异质性和亚群特异性功能的定义还不够完善;致病因素(如胆管病变中的胆汁酸,非酒精性脂肪性肝病中的脂质及其产物,病毒性肝炎中的适应性免疫)对不同类型肝病患者巨噬细胞激活的影响不同等。此外,巨噬细胞并非静态,它可以根据所处微环境的改变迅速做出反应,改变自身极化状态。在一种疾病状态下,往往存在多种极化状态的巨噬细胞。巨噬细胞对疾病的影响往往是不同极化细胞的综合效应,这对研究者同样是个挑战。尽管目前对巨噬细胞的研究还存在诸多困难,但是随着研究手段的进步,如单细胞测序技术的普及、多参数组织学分析或系统生物学等方法的应用,我们会对巨噬细胞异质性及其在肝脏疾病中的作用有更深入的了解,为今后将基础研究转化为临床治疗奠定基础。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。