水产喹诺酮类药物使用与检测方法研究进展

黄欣桐，王李宝，黎慧，史文军，陈孝煊，万夕和

（1.江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007；2.华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070）

喹诺酮类药物具有广谱抗菌、杀菌效果好、成本低等优点，常被用于防治水产动物细菌感染。但在水产养殖中，喹诺酮类药物的使用会导致药物残留，影响水产品质量[1]。中国、欧盟、美国和日本等，已将喹诺酮列为动物兽药禁止使用药物产品名单，并规定了最高残留量。水产品中喹诺酮类药物的残留和控制，是该领域发展迫切需要解决的问题之一。在养殖过程中，一些养殖主体忽视用药安全，滥用喹诺酮类药物，导致药物残留超标。而食用残留超标的水产品，可能导致生物肠道菌群失衡，甚至有潜在的致癌风险[2]。目前已有关于喹诺酮类药物毒性[3]、残留限值和残留测定方法[4]方面的研究报道，为合理、科学使用喹诺酮类药物，防止耐药性的产生提供了参考依据。

现简述喹诺酮类药物的使用管理现状、药物残留样品前处理方法、最新检测技术，拟为喹诺酮类药物残留检测相关研究提供参考。

1 喹诺酮类药

喹诺酮类药物是一类常见的人畜共用的人工合成类抗菌药，在国际上被誉为最重要的高效广谱抗菌药。因其结构中含有氟原子，称之为氟喹诺酮类抗生素（FQs），目前已发展到第四代。抑菌机理为通过抑制DNA 螺旋酶而达到抑菌作用。目前使用最多的是第三代氟喹诺酮类抗生素，主要包括环丙沙星（CIP）、诺氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFL）、洛美沙星（LOM）、恩诺沙星（ENR）等。此类抗生素因抗菌谱广、抗菌性强、口服吸收好等优势，被广泛应用于人类及动物疾病治疗。

根据发明顺序及其抗菌谱喹诺酮类药物分为四代：第一代产品主要对痢疾大肠杆菌、大肠杆菌、克雷白杆菌和部分变形杆菌有抗菌活性；第二代产品具有广泛的抗菌谱，对绿脓杆菌、肠杆菌科、马氏沙雷杆菌具有一定抗菌活性；第三代产品的抗菌谱进一步扩大，包括革兰阳性、阴性菌；第四代引入8-甲氧基，加强了抗厌氧菌活性，抗菌谱进一步扩大到衣原体、支原体等病原体，且药物的不良反应更小[5]。历代喹诺酮药物的优、缺点及抗菌谱差异见表1。

表1 历代喹诺酮药物的优缺点、抗菌谱差异

2 使用现状

1980 年，抗生素开始在水产养殖中使用，主要用来控制病原微生物，减少养殖对象的感染风险。起初抗生素主要用于具有重要经济效益的养殖品种，1990 年后，其使用范围逐步扩大，大多数海水和淡水养殖品种均有使用[13]。

2018 年，我国养殖业使用的兽用抗菌药有69 种，其中10 种为氟喹诺酮类药物，占总量的14.5%。在兽用抗菌药的使用品种和数量上，氟喹诺酮类与β-内酰胺类及抑制剂类、磺胺及增效剂类并列第一[14]。喹诺酮类药物在畜禽、水产、蚕等养殖动物中均有使用。其药物代谢特点与使用对象及给药途径有密切关系，同时这些也影响着药物的吸收速度、数量及作用强度。1982—2000 年，水产养殖中常用的抗生素药物在我国逐步研制成功[15]。目前，越南和中国使用抗生素的种类较多，分别为31 种和17 种，以特色水产养殖为主且养殖强度较低的国家，如印度尼西亚和孟加拉国，使用抗生素的种类较少。水产养殖中允许使用的喹诺酮类药物种类见表2。

为降低水产品中喹诺酮类药物残留的风险，各国对部分药物设定了限量标准，美国则禁止在水产养殖中使用抗菌喹诺酮类药物。2015 年9 月1 日起，中华人民共和国原农业部公告第2292 号明确停止使用洛美沙星等4 种家畜用兽药，并撤销有关兽药上市许可文号[17]。《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中规定，喹酸的最大残留限量为100 μg/kg；《无公害食品 水产品中渔药残留限量》（NY 5070—2002）中，也对喹诺酮类药物的使用作出了规定（表3）。

表3 喹诺酮类药物使用限量

3 药物残留检测前处理方法

3.1 液液萃取法

液液萃取法是一种分离过程，是利用各组分在2 个不相溶（或仅部分相溶）的液相中的不同溶解度，将它们从一个液相转移到另一个液相。2021 年，杨霄等[18]运用盐析辅助液液萃取/高效液相色谱-串联质谱法，测定渔业水体中7 种喹诺酮类抗生素含量。2015 年，黄培婷等[19]采用固相分散萃取-液态微萃取结合超高效液相色谱-质谱联用法，建立了快速、灵敏、简便的测定各种水基中残留抗生素的方法。

3.2 固相萃取法

固相萃取法的目的是减少样品中杂质的干扰，提高测定的灵敏度。2021 年，梁思慧等[20]建立一种新型的固相萃取前处理方法，该方法的基质净化能力显著升高，再结合超高效液相色谱-串联质谱，检测出淡水鱼中四环素和氟喹诺酮残留。2022 年，丁紫荣等[21]采用固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱（SPE-LC-MS/MS）技术，建立了养殖尾水中17 种氟喹诺酮类抗生素（FQs）的测定方法，以养殖尾水为基质，17 种FQs 的加标回收率为47.8%～118.7%，相对标准偏差（RSD）＜20%（n=6）。

3.3 凝胶渗透色谱法

凝胶渗透色谱法的分离过程，是在一个充满多孔物质的柱子上进行。填料颗粒包含许多不同大小的孔洞，不同分子质量的聚合物分子，被淋洗溶液的流出物，按分子质量从大到小分开。2016 年，吴兆凤等[22]建立了凝胶渗透色谱净化-气相色谱三重四极杆串联质谱（GPC-GC-MS/MS），测定奶粉中有机氯农药残留的分析方法，采用凝胶渗透色谱技术，成功检测出有机氯农药残留。

3.4 QuEChERS 萃取法

QuEChERS 的方法本质上是振荡萃取、液液预处理和基质分散的固相萃取的组合，从而实现了样品预处理。杨金易等[23]采用新型QuEChERS 前处理技术与酶联免疫法结合，快速检测水产品中3种喹诺酮类残留。章红等[24]以QuEChERS 样品预处理方法、四极杆飞行时间高分辨质谱（Q-TOF MS）为检测手段，建立了典型水产品中的15 种喹诺酮类药物残留的快速筛查方法。

3.5 分子印迹固相萃取方法

分子印迹技术是基于模拟抗原-抗体、酶-底物等生物分子识别特异性的仿生分子识别技术[25-26]，是一种制备具有分子特异识别功能聚合物的技术。分子印迹聚合物可以对目标化合物进行特异性选择，使其能够分离复杂样品中的特定成分，具有较高的储存能力，可以从环境中吸收低浓度的目标化学品，具有较高的检测灵敏度。刘芃岩等[27]同时以左氧氟沙星和环丙沙星为模板分子，合成了复合模板分子印迹聚合物，可同时测定鱼肉中10 种FQs含量，可以满足水产品中FQs 类药物的确证和多残留分析的要求。2019 年，王瑞等[28]建立了同时测定鸡肉中16 种喹诺酮类药物残留的分子印迹固相萃取（MISPE）-超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法，该方法灵敏度高，操作简单、快速。

3.6 固相微萃取法

固相微萃取法的基础，是使用涂有固相的石英玻璃纤维来吸附和聚集样品中被测物质。2010 年，孙福江等[29]建立了顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相质谱（GG-MS），检测苹果中氨基甲酸酯类农药的方法。

以上6 种喹诺酮类药物检测的前处理方法各有优缺点（表4）。研究和分析人员必须针对需要检测的喹诺酮类药物的特性和试验目的，选择合适的样品处理方法，以期获得快速、准确、可靠的检测结果。

表4 喹诺酮药物样品前处理方法的优缺点[30-31]

4 检测技术

4.1 酶联免疫吸附分析法

酶联免疫吸附分析法（ELISA）是使用最广泛的免疫测定方法。在基本方法中，已知的抗原或抗体被吸附在一个固相支持物的表面上，酶标抗原-抗体反应就在固相的表面上进行，而液相中游离的部分被洗掉。最常用的ELISA 法是双抗体夹心法，用于检测大分子抗原，间接法用于检测特定的抗体[32]。王强等[33]建立了检测水产品中氟喹诺酮类药物残留的直接竞争酶联免疫吸附分析方法。

4.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法（GICT），是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。以胶体金为标记物，与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色,以纤维膜上显色带的有无进行定性检测。2018 年，宗婧婧等[34]采用胶体金免疫层析法，水产样品用0.1%甲酸乙腈溶液提取，正己烷除脂，胶体金试纸条检测，检测出15 种喹诺酮类药物。2021 年，罗梅霞[35]制备的抗FQs 单克隆抗体M4E3 洛美沙星、氧氟沙星和恩诺沙星等8 种FQs，有较高的交叉反应率，基于此抗体所建立的胶体金免疫层析法，可以在现场快速灵敏地检测猪肉和鸭肉中的这8 种FQs。

4.3 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPIC）是一种以高压液体作为流动相、以传统液相为基础的色谱过程。日常所说的柱色谱法、薄层色谱法或纸色谱法是经典的液相色谱法。在这些方法中，＞100 mm 的吸附材料（硅胶、氧化铝等）被用作固定相。朱品玲等[36]应用HPIC法，建立了测定水产品肌肉中4 种喹诺酮类残留量的方法，采用乙腈-二氯甲烷（4∶3，V/V），为提取液，浓缩至干，用20%乙腈水溶解残留物。

4.4 液相色谱-串联质谱法

液相色谱-串联质谱法是一种将多种高效组成成分都定量于一体的分析方法，对高沸点、不具有挥发性和对热不稳定性的极性化合物进行分离检测和含量分析。高效液相色谱串联质谱法主要用于强极性、难挥发和热不稳定性的化学物。Meng 等[37]测定了牛奶中8 种氟喹诺酮类药物含量，建立了低于最大残留量浓度的多残留分析方法。Magda 等[38]仅用0.5 mL 有机溶剂萃取样品，在0.25～2.0 mL 内回收率良好；以600 多个牛奶样品对检测限、定量限和适用性进行评价，结果均良好。梁晶晶等[39]应用最新型的固相萃取（PRiME HLB）净化技术，采用超高效液相色谱-串联四极杆质谱（UPLC-MS/MS），建立了水产品中19 种喹诺酮类药物残留的检测方法。

4.5 化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析法由2 部分组成，一个免疫反应系统和一个化学发光检测系统。化学发光免疫分析在国内畜禽领域的应用相对较多，在水产领域应用相对较少。2008 年，官婷婷[40]利用盐酸四环素本身没有化学发光且会使化学发光免疫分析系统的化学发光明显消失的性质，对人类晨尿样品中的盐酸四环素进行了检测。

为进一步了解样品检测的便捷性、准确性和检测成本等因素，对比不同的检测方法的优缺点（表5），选择合适的喹诺酮类药物检测方法，以期在较短时间内，获得准确、可靠的检测结果，为下一步抗生素的使用和管理提供有效的数据支撑。

5 结语

随着水产养殖绿色健康发展的推进，在预防和治疗养殖对象的疾病中，抗生素依旧起着重要作用，因此抗生素使用导致的细菌耐药性[44-46]、环境污染及水产品抗生素的残留问题[47]依然存在。在水产品喹诺酮类药物残留检测中，用于样品前处理的固相萃取[48-49]和QuEChERS[50-51]方法，检测成本低、效率高；用于样品检测的高效液相色谱法、液相色谱-质谱法和酶联免疫法等[52]，目前使用最广泛的为高效液相色谱法。