锌和镍离子对鲫肠道黏膜重要酶活性的影响

胡雨佳，王伟，倪静媛，张盛周

（安徽师范大学生命科学学院，安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室，安徽 芜湖 241000）

随着我国工业化和城市化的不断发展，大量含有重金属离子的工业废水被排放到水体环境中，导致水域重金属污染日益严重。锌和镍为水体重金属污染的主要元素，可在鱼体内富集，并与生物体内的蛋白质等高分子物质结合或者与DNA 等相互作用，引起不可逆转的变性或遗传突变，阻碍生理或代谢过程的正常进行，进而影响鱼类的生长发育和繁殖等，甚至出现胚胎、幼体致死现象[1-5]。

鲫（Carassius auratus），隶属鲤科，鲫属，是一种温水性鱼类，在我国分布广泛。鲫肉味鲜美、营养丰富，可进行人工养殖，具有较高的经济价值[6]。研究表明，重金属离子在鲫体内富集后，与酶和核酸等生物大分子相互作用，引起鲫中毒或死亡[7]。目前有关重金属离子对鲫肠道黏膜上酶活性的影响研究未见报道。现以鲫为研究对象，探讨不同浓度的锌和镍离子对其肠道黏膜中过氧化物酶（POX）、非特异性酯酶（NSE）、碱性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）和三磷酸腺苷酶（ATPase）5 种酶活性的影响，以期为鱼类的清洁养殖和污染防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜活鲫5 条，体长为20～25 cm，体质量为350～500 g，购于芜湖市黄山西路菜市场。购回后清水静养2～3 h，待其将肠道残留物排出。

1.2 制备组织切片

解剖并取鲫中肠，切成5 mm 的肠段，用0.1 mol/L磷酸缓冲液清洗干净，于OCT 包埋剂包埋，冰冻切片，制成厚度8 μm 的组织切片，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 金属离子处理

分别设置2×10-5，2×10-4，2×10-3，2×10-2和2×10-1mol/L 5 个不同浓度的硫酸锌和氯化镍试验组，并对应设置2 个空白对照组。每个试验组和对照组均放入5 块鲫肠组织切片，30 min 后吸除离子溶液，进行酶组织化学染色。

1.4 酶组织化学染色

采用酶组织化学染色法，对金属作用过的鲫组织切片进行染色，POX 采用DAB 法、NSE 采用偶氮法、ALP 采用NBT/BCIP 法、ACP 采用铅法、ATPase采用钙-钴法，染色方法参考文献[8-9]，染色时间根据颜色反应强度适当调整。

1.5 数据分析

使用BX61 型显微镜观察并拍照记录各酶组织化学染色结果。利用Image-Pro Plus 分析软件，对酶组织化学染色的阳性部位进行光密度分析，测出其面积（Area）与累积光密度值（IOD），计算出IOD 与Area 的比值，即用平均光密度值来表示酶活性大小。最后利用SPSS 软件中的单因素分析法，将不同离子浓度梯度下的酶活性与对照组进行比较，得出不同浓度梯度的金属离子对酶活性影响的差异显著性。P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 鲫肠道黏膜5 种重要酶的组织化学染色特征

鲫肠道黏膜中5 种重要酶均呈现明显的酶组织化学染色反应。POX 酶组织化学反应呈棕红色，颗粒状，主要分布于肠道黏膜上皮细胞的纹状缘和固有层，见图1（a）；NSE 酶组织化学反应呈砖红色，主要分布于黏膜上皮细胞的顶部和基部，在固有层中呈颗粒状分布，见图1（b）；ALP 酶组织化学反应呈蓝紫色，主要分布于黏膜上皮细胞的顶部，固有层中亦有少量分布，见图1（c）；ACP 酶组织化学反应呈棕黄色，主要分布于固有层，部分黏膜上皮细胞的基部亦有少量分布，见图1（d）；ATPase 酶组织化学反应呈棕黑色，主要分布于黏膜上皮细胞的纹状缘，固有层亦有少量分布，见图1（e）。

图1 鲫肠道黏膜5 种重要酶的组织化学染色

2.2 锌离子对鲫肠道黏膜5 种重要酶活性的影响

经光密度分析，不同浓度的锌离子（Zn2+）作用下鲫肠道黏膜5 种重要酶活性见表1。由表1 可见，随c（Zn2+）的增高，POX 活性呈减弱趋势。当c（Zn2+）≤2×10-4mol/L 时，对POX 活性无显著影响（P＞0.05），当c（Zn2+）≥2×10-3mol/L，POX 活性被极显著抑制（P＜0.01）；在c（Zn2+）为2×10-5mol/L时，NSE 活性极显著增强（P＜0.01），当c（Zn2+）≥2×10-4mol/L 时，NSE 活性被极显著抑制（P＜0.01）；当c（Zn2+）为2×10-5mol/L 时，对ALP 活性无显著影响（P＞0.05），当c（Zn2+）≥2×10-4mol/L 时，ALP 活性呈减弱趋势，其中c（Zn2+）为2×10-4mol/L 时差异显著（P＜0.05），c（Zn2+）≥2×10-3mol/L 时差异极显著（P＜0.01）；当c（Zn2+）≥2×10-5mol/L 时，ACP 活性被极显著抑制（P＜0.01），且随c（Zn2+）升高ACP活性减弱；当c（Zn2+）为2×10-5mol/L 时，ATPase 活性极显著增强（P＜0.01），当c（Zn2+）≥2×10-4mol/L时，ATPase 活性被极显著抑制（P＜0.01）。

表1 不同浓度Zn2+作用下鲫肠道黏膜5 种重要酶活性①

续表

2.3 镍离子对鲫肠道黏膜5 种重要酶活性的影响

经光密度分析，不同浓度镍离子（Ni2+）作用下鲫肠道黏膜5 种重要酶活性见表2。由表2 可知，POX 活性随c（Ni2+）的升高呈先增强后降低的趋势。当c（Ni2+）为2×10-5mol/L 时，POX 活性极显著增强（P＜0.01），当c（Ni2+）≥2×10-2mol/L 时，POX 活性被极显著抑制（P＜0.01）；当c（Ni2+）为2×10-5mol/L 时，NSE 活性显著增强（P＜0.05），当c（Ni2+）≥2×10-2mol/L时，NSE 活性被极显著抑制（P＜0.01）；当c（Ni2+）为2×10-5mol/L 时，对ALP 和ACP 活性无显著影响（P＞0.05），当c（Ni2+）≥2×10-4mol/L，ALP 和ACP 活性均逐渐降低，且与对照组差异均极显著（P＜0.01）；c（Ni2+）为2×10-5mol/L 时，ATPase 活性极显著增强（P＜0.01），当c（Ni2+）≥2×10-3mol/L 时，ATPase 活性被极显著抑制（P＜0.01）。

表2 不同浓度Ni2+作用下5 种重要酶活性①

3 讨论

鱼类的胃和肠道是消化和吸收的主要器官，参与离子、水和营养物质的运输和吸收[10-11]。其中肠道酶活性对营养物质的吸收至关重要，已有研究证明，温度、pH 值及饲料添加剂等[12-14]均对鱼类酶活性有影响。因此，通过探讨Zn2+和Ni2+对肠道酶活性的影响，有助于增进对鱼类的毒理认识。

3.1 过氧化物酶（POX）

过氧化物酶是过氧化物酶体的标志酶，是一类氧化还原酶，可催化过氧化氢分解，氧化酚类、胺类和烃类化合物，消除其对机体的毒性作用[15-16]。刘树青等[17]研究表明，POX 具有减少自由基对正常细胞的损伤作用，可以清除细胞生理代谢过程中产生的活性氧，从而提高机体的解毒功能和防病抗病能力。陈剑兴等[18]的研究表明，镉对POX 活性具有毒物兴奋效应，即低浓度激活高浓度抑制的现象，这与本研究结果相一致。本研究显示，低浓度Zn2+对POX 活性无显著影响（P＞0.05），但低浓度Ni2+对POX 活性有显著促进作用（P＜0.05）；而高浓度的Zn2+和Ni2+则对POX 活性均具显著抑制作用（P＜0.05）。可见，高浓度的Zn2+和Ni2+会通过抑制POX的活性，降低机体解毒功能和防病抗病能力。

3.2 非特异性酯酶（NSE）

非特异性酯酶属于水解酶类，参与大部分脊椎动物包括鱼类，对脂肪酸和甘油酯类物质的消化和吸收[19]，对鱼类获取能源物质有重要作用[20]。NSE 在低浓度Zn2+或Ni2+处理下活性增强，但随着离子浓度的增加，酶活性减弱，表明低浓度的Zn2+和Ni2+对NSE 活性有促进作用，高浓度的Zn2+和Ni2+会抑制NSE 活性，这与铅对栉孔扇贝（Azumapecten farreri）NSE 活性的影响结果一致[21]。可见，在低浓度Zn2+或Ni2+作用下会增强NSE 活性，促进机体消化吸收营养物质来获取能源，抵抗重金属离子的胁迫作用。但高浓度Zn2+和Ni2+会抑制NSE 活性，从而阻碍机体对能源物质的获取，对机体产生毒害作用。

3.3 碱性磷酸酶（ALP）

碱性磷酸酶是在肠上皮细胞中，对磷化物以及其他物质的消化、吸收和转运起着重要作用的酶类，其活力大小可以反映细胞对钙、磷以及其他营养物质的吸收能力[22]。本研究结果表明，Zn2+和Ni2+对鲫肠道黏膜上的ALP 活性有抑制作用，且抑制效果随浓度的升高而增强，与镉对鲫肠ALP 的抑制作用相一致[23]。王秋颖等[22]研究表明，钙、磷供应不足，对动物的影响主要表现为骨结构异常、软骨病、食欲降低、生长迟缓、生产性能下降等。因此，当Zn2+和Ni2+超标时会抑制ALP 活性，从而阻碍鲫的磷循环和物质吸收转运，影响鲫的生长发育。

3.4 酸性磷酸酶（ACP）

酸性磷酸酶是溶酶体中的标志酶，与细胞内蛋白质的消化吸收和转运有关，胞饮作用也被认为是硬骨鱼类吸收和消化蛋白质的一种途径[24-25]。本研究结果表明，ACP 活性随Zn2+和Ni2+浓度的升高而降低，与镉对鲫肠ACP 活性和铅对鲫肝胰ACP活性的影响结果一致[23，26]。可见，当Zn2+和Ni2+浓度升高会抑制ACP 活性，阻碍肠道细胞对蛋白质的吸收与利用。

3.5 三磷酸腺苷酶（ATPase）

三磷酸腺苷酶是一类催化ATP 水解的酶并伴随能量的释放，一般存在于组织细胞膜及细胞器膜上，维持细胞膜内外的离子梯度差，保证各种代谢活动能量的供给[27]。在鲫肠道中，ATPase 主要是对营养物质的消化和吸收提供能量。本研究结果表明，在低浓度Zn2+或Ni2+作用下，ATPase 活性增强，但在高浓度下酶活性被抑制，与铜和镉对鲫肝胰脏ATPase 活性的影响及NiSO4（硫酸镍）对大鼠（Rattus norregicus）心肝肾ATPase 的影响结果相一致[28-29]。刘存岐等[30]在金属离子对中国对虾（Penaeus chinensis）幼体内ATPase 活性的影响研究中发现，ATPase 活性的高低和对虾的生长速度快慢呈现出极大的一致性，表明ATPase 活性会直接影响生物机体的生存能力。因此当水环境中的Zn2+和Ni2+含量过高时会抑制ATPase 的活性，同样会对鲫健康状态和生存产生负面影响。

Zn2+和Ni2+对5 种酶活性的影响均具有一定的剂量-效应关系。水体中Zn2+和Ni2+含量超标，会抑制鲫肠道黏膜中重要酶的活性，阻碍机体抗病和消化吸收营养物质的能力，从而影响其生长和发育。本研究结果也表明，鲫肠道黏膜中重要酶活性的高低，可以作为反映水体Zn2+与Ni2+污染的指示指标。