UPLC-MS/MS 法测定水产品中7 种喹诺酮类兽药残留

陶威，张苏珍，田蕴*，王益军，龚其龙，彭程

（1.连云港市畜产品质量监督检验测试中心，江苏 连云港 222000；2.连云港市连云区渔业技术推广站，江苏 连云港 222042；3.句容市水产技术指导站，江苏 镇江 212400）

喹诺酮（QNs）类药物因抗菌谱广、价格低廉、使用方便以及抗菌机制独特等特点，在水产品养殖过程中广泛使用。然而，QNs 在食品性水产中的残留，可直接对人类造成危害，此外长期大量使用这类药物造成的低浓度的残留药物，可能会对敏感致病菌产生耐药性，且部分QNs 还有潜在的致癌风险[1-3]，从而间接威胁到人类的健康。因此，对水产品中喹诺酮类药物残留进行检测具有重要意义。

本研究以青鱼（Mylopharyngodon piceus）、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和南美白对虾（Penaeus vannamei）为试验对象，建立了青鱼、泥鳅、南美白对虾肌肉组织中7 种QNs 药物[恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、诺氟沙星（NOR）、洛美沙星（LOM）、沙拉沙星（SAR）、和培氟沙星（PEF）]残留的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），以期为开展水产食品中QNs 类药物残留测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 标准品、主要试剂与材料

恩诺沙星标准品：99.78%，德国Dr.Ehrenstorfer，批号93106-60-6；环丙沙星标准品：92.31%，德国Dr.Ehrenstorfer，批号93107-08-5；氧氟沙星标准品：95.71%，德国Dr.Ehrenstorfer，批号82419-36-1；诺氟沙星标准品：97.26%德国Dr.Ehrenstorfer，批号70458-96-7；洛美沙星标准品：97.26%，德国Dr.Ehrenstorfer，批号98079-52-8；沙拉沙星标准品：85.82%，德国Dr.Ehrenstorfer，批号91296-87-6；培氟沙星标准品：92.19%，德国Dr.Ehrenstorfer，批号70458-95-6。

恩诺沙星-D5 盐酸盐标准品：99.8%，德国WITEGA；环丙沙星-D8 标准品：94.3%，德国WITE GA，批号1216659-54-9；氧氟沙星-D3 标准品：99.1%，德国WITEGA，批号1173147-91-5；诺氟沙星-D5标准品：80.4%，德国WITEGA，批号1015856-57-1；洛美沙星-D5 盐酸盐标准品：99.3%，德国WITEGA；沙拉沙星-D8 盐酸盐标准品：91.1%，德国WITEGA；培氟沙星-D5 标准品：99.4%，德国WITEGA，批号1228182-51-1。

甲醇、乙腈、甲酸：色谱纯，美国Merck 有限公司；超纯水：实验室自制（美国Millipore 公司），符合《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T 6682—2008）；有机滤膜（0.22 μm）：上海安普科技有限公司；Oasis PRIME HLB 固相萃取柱：美国Waters 公司。

1.2 试验仪器

超高效液相WatersTQ-S（配有自动进样器和柱温箱，美国Waters 公司）；三重四级杆串联质谱仪（配备电喷雾离子源，美国Waters 公司）；软件MassLynx 4.2（美国Waters 公司）；电子分析天平：CPA 225D 型（德国Sartorius 公司）；固相萃取仪Supelco 24 位（美国Supelco 公司）；台式高速冷冻离心机：3-30 KS 型（德国sigma 公司）；超声波清洗器：SK 8200 H 型（上海科导公司）；旋转蒸发仪：Hei-VAPPrecision 型（德国Heidolph 公司）；氮吹仪：N-EVAP 24 位型（美国Organomation 公司）；超纯水仪：Milli-QAdvantageA 10 型（美国Millipore公司）；基本型圆周混合器：0～3 000 r/min（德国IKA 公司）。

1.3 样品采集

从江苏省东辛农场水产养殖有限公司选择个头均匀、鳞片完好且较为光泽、健康活跃的青鱼4 尾，平均体质量为（350±20）g，平均体长为（23±2）cm；选择个头均匀、健康活跃的南美白对虾2 kg，平均体长为（10±2）cm，平均体质量为（12±2）g；从赣榆区墩尚镇某泥鳅养殖场，选择体表完好、健康活跃的泥鳅20 尾，平均体长为（15±1）cm，平均体质量为（70±10）g。将试验动物进行解剖，采集可食用组织样品进行编号，放入准备好的塑封袋中，于-18 ℃冷冻备用[4]。

1.4 分析条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC○R BEH C18 色谱柱，1.7 μm，（2.1×50）mm；保护柱：VanGuard TM Pre-Column3/PK，（2.1×5）mm；流动相A：0.1%（体积分数）甲酸水溶液；流动相B：纯甲醇；流量0.3 mL/min；进样体积5 μL；柱温40 ℃。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

质谱条件：电喷雾离子化方式下正离子电离（ESI+）；扫描方式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：800 kV；锥孔电压：10 V；汽化温度：550 ℃；去溶剂气流量：1 000 L/h；锥孔反吹气：150 L/h；碰撞能量：4 eV。

第一个四级杆，低质量数端：2.8 u，高质量数端：14.72 u；离子能量：0.1 eV。第二个四级杆，低质量数端：2.8 u，高质量数端：14.78 u，离子能量：0.5 eV。

1.5 样品前处理

肌肉样品于室温下解冻，称取（2.0±0.02）g，于50 mL 聚丙烯离心管中，准确加入20 μL 质量浓度为1 mg/L 的混合内标标准工作液，加入10 mL 1%酸化乙腈溶液，涡旋震荡萃取10 min，超声波萃取5 min，10 000 r/min 离心10 min，无须活化和平衡，取6 mL 上清液直接注入6 mL Prime HLB（6 cm3200 mg）固相萃取柱，保持1 滴/s 的流量，收集全部流出液。取5 mL 流出液，在40 ℃下氮吹至＜0.5 mL。残渣液体用流动相溶液定容至1 mL，经0.2 μm 滤膜过滤，供UPLC-MS/MS 测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

对比分析了在流动相中分别加入乙酸铵和甲酸目标响应和峰形图。结果表明，0.1%甲酸水和乙酸铵目标响应值相差不大，但是在0.1%甲酸水条件下，化合物的峰型更对称，因此选择0.1%甲酸水溶液作为水相。分析了0.1%甲酸-乙腈和0.1%甲酸-甲醇为流动相时7 种QNs 药物的分离效果，结果表明，当有机相为乙腈时，出峰时间较快，但恩诺沙星、诺氟沙星和恩诺沙星-D5 的出现双头峰，物质分离效果不佳，组分重合，分离度达不到要求，导致定量不准、线性不佳。当有机相为甲醇时，出峰时间较乙腈偏后，但各物质的峰型对称，分离效果较好，标准曲线线性较好。因此本试验采用0.1%甲酸水-甲醇作为流动相。7 种QNs 药物正离子扫描特征离子色谱图见图1[5-6]。

图1 7 种QNs 药物及其同位素内标的正离子扫描特征离子图

2.2 质谱条件优化

试验选用甲醇-0.1%甲酸水溶液（体积比为1∶1），配制成100 μg/L 7 种QNs 药物的标准品工作液和7 种QNs 同位素内标标准工作液，作为质谱调谐液，通过针泵直接进样分析，正离子扫描模式，针泵流量10 μL/min。试验使用的是三重四级杆分辨质谱，选择质谱多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）模式进行数据的采集[7-8]。得出多反应监测条件，离子对、锥孔电压，碰撞能量见表2。

表2 7 种QNs 药物的分子质量和质谱参数①

续表

2.3 方法线性和检出限

准确量取7 种QNs 药物混合溶液，用10%甲 醇水溶液稀释成浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 和100.0 μg/L 的标准工作溶液，含内标物浓度为10.0 μg/L，供液相色谱-串联质谱仪测定[9]。内标法以各特征离子质量色谱峰与相应同位素内标的峰面积为纵坐标，对照溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程及相关系数见表3。由表3 可见，7 种QNs 药物浓度0.5～100.0 μg/L 呈良好的线性关系，相关系数（R2）为0.998 446～0.999 799。

根据特征离子色谱峰信噪比[（S/N）=3]，计算得出7 种QNs 药物检出限为0.01～0.34 μg/kg。按照S/N=10，得出7 种QNs 药物定量限为0.04～0.87 μg/kg。见表3。

2.4 回收率

称取青鱼、泥鳅和南美白对虾空白样品，7 种QNs 药物在5.0，10.0 和20.0 μg/kg 添加水平下，按照1.5 方法进行前处理，每个水平重复3 次，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表4。由表4可见，7 种QNs 药物回收率在青鱼中为92.71%～105.31%，泥鳅中为92.31%～109.38%，南美白对虾中为92.31%～106.76%。结果表明，该方法具有较好的回收率，可以满足青鱼、泥鳅、南美白对虾中7 种QNs 药物残留的日常检测要求。

表4 青鱼、泥鳅、南美白对虾中7 种QNs 的平均回收率和RSD

续表

2.5 精密度

按照1.5 前处理方法，分别称取青鱼、泥鳅、南美白对虾样品，进行阳性添加，在5.0，10.0 和20.0 μg/kg 添加水平下，重复6 次，进行分析测定，计算RSD。同样操作方法，连续测定3 d，计算日间精密度RSD，结果见表5。由表5 可见，青鱼中7 种QNs 日内精密度RSD 为0.68～6.54，日间精密度RSD 为1.16～8.49；泥鳅中7 种QNs 日内精密度RSD 为1.84～6.94，日间精密度RSD 为2.48～8.27；南美白对虾7 中QNs 日内精密度RSD 为0.29～8.29，日间精密度RSD 为1.45～8.14。该方法具有较好的重复性和精密度，可以满足青鱼、泥鳅、南美白对虾中7 种QNs 药物残留的日常检测要求。

表5 青鱼、泥鳅、南美白对虾中7 种QNs 的平均回收率和RSD

续表

3 结论

本试验建立了水产品中7 种喹诺酮类兽药残留的检测方法——超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）。该方法与普通液相色谱法相比，定性定量更准确，检测速度提升，分离时间短，方法的灵敏度和重现性较好，稳定性高，能较好地满足水产品中喹诺酮类药物残留分析的检测要求，同时溶剂用量大为减少，降低了分析成本，使检测效率得到提升，可以用来检测水产品中7 种喹诺酮药物的残留量。