石斑鱼神经坏死病毒研究进展

陈俊羽，张婧

（广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006）

石斑鱼（Epinephelusspp）是鮨科石斑鱼属鱼类的总称，已经报道的有400 余种，其中我国沿海地区有记录的45 种，主要有斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）、赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）、棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）和鞍带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）等[1]。石斑鱼常栖息于热带、亚热带暖水水域的礁石附近，最适生存水温为22～28 ℃，在盐度＞10%的海域均可生存。石斑鱼为肉食性鱼类，捕食对象包括甲壳类和各种小型鱼类[2]。

神经坏死病毒为野田村病毒科的单链RNA 病毒，首次报道于日本长崎水产养殖研究所繁殖的鹦嘴鱼（Amphilophus）和澳大利亚北昆士兰州某孵化场养殖的澳洲肺鱼（Neoceratodus forsteri）中[3]。神经坏死病毒可通过垂直或水平传播方式侵染个体，引起鱼类患病毒性神经坏死病，处理不当会导致鱼类大批死亡。神经坏死病毒对渔业和水产养殖业的发展具有严重的危害[4]。在石斑鱼养殖中，神经坏死性病可感染石斑鱼脑部和眼部组织，严重时会导致个体死亡。在石斑鱼的生长周期中，稚鱼时期及成熟度相对较高的幼鱼期易感染，且死亡率达到60%～100%[5]。

石斑鱼神经坏死病的致病机理、检测方法以及防治措施一直是研究人员关注的重点和难点。现简述石斑鱼神经坏死病毒的研究进展。

1 神经坏死病毒的分类

目前神经坏死病毒主要有2 种分类方式：基因型和血清型。1997 年，Nishizawa 等[6]通过分子系统发育，分析25 种神经坏死病毒RNA2 序列第604～1 030 位碱基的差异，把神经坏死病毒分为4个基因亚型，即红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）神经坏死病毒（TPNNV）、拟鲹（Pseudocaranx）神经坏死病毒（SJNNV）、条斑星鲽（Verasper moseri）神经坏死病毒（BFNNV）和赤点石斑鱼型神经坏死病毒（RGNNV）。随着生物技术的发展，2010 年，Johansen 等[7]通过序列比对，发现了第5 种神经坏死病毒的基因型：大菱鲆（Scophthalmus maximus）型神经坏死病毒。这一研究，进一步完善了神经坏死病毒的基因型分类依据。

2003 年，Morit 等[8]根据来源于日本、印尼、泰国、希腊、美国和澳大利亚等20 种神经坏死病毒的血清，开展中和试验，将神经坏死病毒分为3 种血清型：A、B 和C，见表1。拟鲹神经坏死病毒属于血清型A 类，宿主为黄带拟鲹（Pseudocaranxdentex）；红鳍东方鲀神经坏死病毒属于血清型B 类，赤点石斑鱼神经坏死病毒与条斑星鲽神经坏死病毒同属于血清C 类。赤点石斑鱼神经坏死病毒的宿主多为温水鱼类，条斑星鲽神经坏死病毒的宿主多为冷水鱼类，虽然属于不同的基因型分类，但是由于其衣壳蛋白序列的相似性较高，导致这2 种病毒之间存在共同的表位，即相同的血清类型。

表1 鱼类神经坏死病毒的基因型与血清型[3]

2 神经坏死病毒的结构

神经坏死病毒粒子呈20 面体对称结构，无囊膜包裹，直径约25～30 nm。180 个衣壳蛋白，以三聚体形式构成高度对称的中空结构，其中P 结构域由8 个反向平行的β 折叠和1 个α 螺旋折叠，形成独立的表面突起，在病毒的黏附入侵过程中发挥着重要作用。排列整齐的N 臂主要存在于20 面体内表面的二重界面处，通过N 端在三重轴处形成β 环。S结构域和P 结构域通过连接区域连接，二者在空间上并不直接接触。60 个P 结构域三聚体在三重轴上相互连接形成表面突起[9]。

3 侵染石斑鱼引发的免疫反应机制

研究表明，宿主细胞表面受体在病毒入侵过程中发挥重要作用，可以是病毒进入细胞的通道，也可以引发细胞自噬，诱导细胞凋亡[10]。Zhang等[11]研究发现，赤点石斑鱼神经坏死病毒表面的衣壳蛋白，与受体海鲈（Perca fluviatilis）热休克蛋白90ab1 结合后，抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路，引发细胞自噬过程。这一结果，初步揭示了神经坏死病毒在侵染初期的细胞应答机制。巨噬细胞是硬骨鱼类先天免疫系统的关键组成部分。活化的巨噬细胞分泌免疫因子指导炎症的消退，对于鱼体的健康至关重要[12]。小胶质细胞被认为是中枢神经系统中的免疫效应因子，在点带石斑鱼（Epinephelus coioides）中枢神经系统损伤的治疗中发挥重要作用。研究发现，神经坏死病毒进入石斑鱼脑组织后，小胶质细胞可以转化为M1 型或M2 型活化巨噬细胞。M1 型活化巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子1（TNF-R1），导致肿瘤坏死因子α（TNFα）表达水平升高，抗炎细胞因子IL-10 降低，引发神经系统损伤。与之相对，M2 型巨噬细胞分泌抗炎细胞因子IL-10 和肿瘤坏死因子2（TNF-R2）能够减轻脑部挫伤，促进神经元恢复，可降低病毒对脑和神经组织的伤害[13-14]。

4 感染模型的建立

在细胞生物学层面，1991 年，Frerichs 等[15]以条纹月鳢（Channomuraena vittata）细胞为基础，成功建立神经坏死病毒感染模型，标志着细胞生物学检测方法的正式建立。目前已经建立的神经坏死病毒敏感细胞系，包括褐点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）鳍条组织、心脏组织以及鳔部细胞系[16]、青石斑鱼及斜带石斑鱼脑组织细胞系[17]、云纹石斑鱼（Epinephelus moara）吻部、心脏、脑部、肾脏、脾脏以及性腺组织细胞系等[18]。研究人员以上述细胞系为基础，将神经坏死病毒大量增殖形成空斑等拉网病变后，进行分离纯化，获得具有一定感染能力的活病毒，从而达到检测的目的。

5 检测方法

目前常用的神经坏死病毒检测方法有分子生物学检测法、电化学检测法以及免疫学方法。在分子生物学层面，荧光定量PCR 技术、环介导等温扩增技术和交叉引物等温扩增技术等，都是常用的神经坏死病毒检测方法。其中，荧光定量PCR 技术较为常见。测试发现，该方法在检测点带石斑鱼神经坏死病毒感染时，灵敏度较高，但耗时较长[19]。Zhao 等[20]在聚合酶链式反应体系中加入SYTO-9 荧光染料后，实时检测扩增曲线，将所需的检测时间缩短至40 min，满足了疾病检测快速准确的诊断要求。目前，纳米银溶胶探针检测方法和切向流试纸条法的电化学检测法引起了研究人员关注，有望成为新兴的神经坏死病毒快速检测方法[21]。

免疫学相关技术为较早应用于神经坏死病毒检测的方法之一。目前，利用免疫学相关技术，应用于水生动物神经坏死病毒检测方法，主要有酶联反应吸附试验和荧光抗体法等。1992 年，Arimoto 等[22]发现，使用酶联免疫吸附技术，在黄带拟鲹的鱼卵、幼鱼和稚鱼中均检测到神经坏死病毒，但是该方法灵敏度不高且需要的鱼组织量相对较大。2018 年，韩国学者Gye 等[23]改进了免疫学检测技术，提高了检测特异性，降低了硬骨鱼抗原-抗体非特异性结合反应引起的背景光密度偏高问题。

6 预防措施

目前石斑鱼神经坏死病的预防措施，主要有转基因饲料预防和接种疫苗预防2 种方式。Lin 等[24]将赤点石斑鱼神经坏死病毒外壳蛋白基因重组至卤虫细胞中，饲喂石斑鱼幼鱼。结果显示，被神经坏死病毒侵染后的幼鱼存活率提高了30%，由此证明口服转基因饲料，可以使石斑鱼幼鱼获得一定的免疫效果。莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）具有生长周期快、性状稳定、遗传背景清晰等特点，郭德权[25]将病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因整合入莱茵衣藻基因组中，利用该转基因混合饲料投喂珍珠龙胆石斑鱼后，进行攻毒试验，采用荧光定量PCR技术，发现神经坏死病毒外壳蛋白mRNA 含量减少60%；病理切片发现，脑组织细胞空泡化数量减少，试验组的平均存活率比对照组高33%。上述研究结果表明，转基因混合饲料对预防石斑鱼病毒性神经坏死病有一定作用。

在石斑鱼病毒性神经坏死病的防治中，以接种疫苗预防为主。目前，针对神经坏死病毒开发的疫苗包括福尔马林灭活病毒疫苗、重组外套蛋白亚基疫苗、病毒颗粒疫苗以及RNA 疫苗等[26]。神经坏死病毒主要作用于石斑鱼幼鱼阶段，该阶段鱼体的免疫系统未充分发育，疫苗的保护效果十分有限[27]。现多采取亲本鱼注射疫苗的方法，切断病毒的垂直传播途径，使子代获得先天性病毒免疫能力[28-29]。Gye 等[30]使用不同效价的疫苗注射七带石斑鱼（Epinephelus septemfasciatus）试验发现，神经坏死病毒灭活疫苗的有效性与诱导免疫细胞产生中和抗体的滴度有关，滴度越高疫苗的保护能力越强。石斑鱼养殖水域的温度也对神经坏死病疫苗的免疫效果有一定影响。研究发现，已接种疫苗的七带石斑鱼在不同水温下，脑部组织中神经坏死病毒的浓度不同，水温为14.3～24.8 ℃，神经坏死病毒疫苗的免疫效果较好[31-32]。现今，寻找神经坏死病毒入侵鱼体后细胞作用的靶点和高效激活免疫通路的相关细胞因子，是疫苗研究的主要方向[33]。

7 治疗方法

注射神经坏死病毒特异性抗体是目前广泛采用的治疗手段。Yamashita 等[33]对七带石斑鱼腹腔内注射福尔马林灭活的赤点石斑鱼神经坏死病毒后，其死亡率明显下降。朱松[34]选取金刚烷胺作为抗神经坏死病毒药物，利用纳米靶向给药系统，延长药物作用时间的同时提高了准确率。但长期使用抗病毒药物会增加病毒的耐药性，且金刚烷胺在鱼体的残留，危害人类健康，因此该治疗方法仍存在一定的争议[35]。

利用碳酸盐缓冲液进行辅助治疗，是防治神经坏死病毒感染的新思路。研究表明，于石斑鱼腹腔内注射pH 值为9.6 的碳酸盐缓冲溶液，可有效清除神经坏死病毒抗原，降低病毒的感染性[36]。2021 年，Gye 等[37]发现，2.0 mol/L 的尿素也可降低神经坏死病毒的抗原性，与对照组相比，试验组病毒的抗原性下降75%～84%。Xiao 等[38]从健康的鞍带石斑鱼中分离出干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、副伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）和路德维希大肠杆菌（Enterobacter ludwigii），并将上述复合益生菌喂食患病的石斑鱼，发现食用益生菌混合饲料的病鱼，眼部和脑组织中神经坏死病毒RNA 的表达量显著下降。这一结果为石斑鱼病毒性神经坏死病的治疗提供了新思路。

8 结语

目前，神经坏死病毒侵染石斑鱼的致病机制仍未完全阐明，感染后的治疗手段也尚未成熟。在防治方法方面，接种疫苗等其他预先建立免疫屏障的防治措施比感染后再治疗的效果更好。与此同时，碳酸盐缓冲液疗法及复合益生菌疗法为治疗手段提供了新思路，在一定程度上解决了抗生素耐药性及水产养殖中抗生素的残留问题，值得推广。