溶解碳源与固体碳源对对虾生物絮团养殖系统的影响

王瑞龙,陈 钊,李 健

(1 中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室,山东 青岛 266071;2上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306)

中国是世界主要的养虾大国,截至2019年,凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的养殖产量超过中国对虾养殖总产量的85%[1]。在凡纳滨对虾养殖面积和产量逐年增加的同时也会伴随着很多养殖问题,水质恶化是最严重的问题之一,由于养殖者追求利益最大化,在对虾高密度、集约化养殖过程中,大量的饲料和对虾代谢物的沉积,会导致养殖水体内源性污染严重,养殖生态环境恶化等一系列问题。开展对虾节水减排型养殖技术研究是中国对虾养殖业的重要发展方向。

(5) 基于既有经验与研究，通常选取地形地貌、地质构造、工程岩组、水系、降雨、植被覆盖、人类活动7个方面作为评价因子。这样可以高效利用基础数据，且可根据经验较为准确地赋值。但今后还可进一步思考完善，提出更优的评价因子组合以及赋值标准。

生物絮团技术的研究发展为对虾节水养殖系统的全面实践应用提供了技术支撑和解决途径[2],生物絮团技术是通过人为添加有机碳源,调节水体中异养菌的数量,通过异养菌对氨氮等养殖代谢产物的吸收同化,从而达到水体净化的过程,同时由微生物絮凝形成的颗粒物质也能被养殖生物所摄食,促进营养循环,提高养殖生物的存活率[3]。通过将生物絮团投入到现实的生产,对养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐氮水平有着显著降低作用[4]。

生物絮团的有机碳物质添加种类比较丰富,总的大类可以分为简单溶解碳源以及复合固体碳源。简单溶解性碳源包括葡萄糖[5]、红糖[6]、糖蜜[7]等,其优点是反应应答快,但是需要在养殖过程中不断添加,使用成本较高;复合固体碳源一般为分子量较大的物质,如木薯渣[8]、马铃薯渣[9]、甘蔗渣[10]等,这一类碳源在微生物作用下被分解为小分子物质,缓慢释放碳源,其优点是稳定持久,同时可以作为载体为硝化细菌等提供充足的附着生长空间,但是反应应答慢,需要的时间长。碳源的种类不仅影响生物絮团培养的时间,还会影响生物絮团的组成结构,添加碳源的种类在很大程度上决定着生物絮团的结构和稳定性[11-12]。王潮辉[5]在生物絮团系统中添加葡萄糖可以加快异养细菌的增殖,更快地同化吸收水体中的氨氮及亚硝酸盐氮,维持水体稳定,但是葡萄糖成本过高,实际养殖效果并不理想;尚谦[8]向水体中添加木薯渣不仅提高了生物絮团系统内部益生菌和异养细菌的丰度水平以及对虾的生长性能,同时解决了农业废弃物的资源化利用问题,但是木薯渣在水质调控方面效果要比蔗糖培养絮团效果差。溶解性碳源与固体性碳源在生物絮团培养中各有利弊,溶解性碳源与固体性碳源混合添加可以联合二者的优势、弥补单独使用时的不足,目前此方面的研究报道较少。

她说，我梦见依旧睡在她卧房旁边。凌晨时分，工作间里响起织布的声音，间歇持续，是从小熟悉的声音。醒不过来，心里想着她已回来，不禁内心释然。我期待她带我上路。期待她从背后拿出一束石竹花。她离去后，我便不知道可以跟随谁。我爱她。在爱她的同时，又轻视她。我站在岸边旁观她如何堕落于海水之中，我看到她死去。

试验在18个150 L聚乙烯塑料水桶内进行,水桶内注入100 L海水,每个水桶内安置2个气石用于充分增氧和搅动水体。每个桶内均匀地放入40尾体色正常,健康有活力的幼虾,并做好记录。饲料投喂时间为每天的06:00、10:00、14:00、18:00、22:00。投饲率按照对虾体质量百分数递减,从试验开始时的5%逐渐减至试验结束时的3%,养殖过程中依据摄食情况进行阶段性调节,对照组每天换水50%,处理组每隔2 d换水30%,所有养殖水桶投喂等量饲料,试验周期为40 d,每日对换水以及喂料作好记录。5个处理组分别以花生壳粉与红糖的搭配比例作为处理,碳源总添加量为日投喂量的70%,将花生壳粉与红糖的添加比例设置5个不同比例梯度(表1)。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用凡纳滨对虾虾苗,幼虾体色正常,健康活泼。试验在青岛瑞滋集团有限公司海洋水产种业创新中心进行,养殖用水取自近岸海水,海水经二次杀菌消毒后投入使用。海水盐度为(32.0±0.4)‰, pH为7.9±0.3,温度为(26.0±0.4) ℃,水体持续充气。对虾配合饲料粗蛋白含量为42%,花生壳粉购自江苏省连云港市联邦农产品深加工工厂,花生壳粉粒径≤0.074 mm(过200目筛网);红糖购自山东金百仓糖业有限公司,含糖量为98%。

1.2 试验准备与设计

本研究将红糖与花生壳粉按照不同比例添加,探究不同碳源添加比例下水体水质变化、养殖环境微生物群落结构以及对虾生长表现,构建经济、稳定、高效的生物絮团养殖系统,为对虾的绿色养殖提供科学依据。

表1 不同碳源的添加比例及试验处理组简称Tab.1 Addition proportion of different carbon sources and abbreviation of experimental treatment group

1.3 日常水质监测

每2 d用水质检测仪(In-Situ,AquaTROLL 400)测定各试验水桶的水温、盐度以及溶氧。生物絮团处理组水体若pH低于7.5,通过添加适量碳酸氢钠溶液缓慢调节至7.8。

1.4 生物絮团微生物样品测定

1949年2月9日，翦伯赞在金毓黻长子金长佑的陪同下来探访金毓黻，翦伯赞谈到“中共方面极注重研究历史”，委托金毓黻帮助联络在北平的史家同行进行座谈。金毓黻是日日记中记载：“翦君著《中国通史》已成首次两册，系用唯物史观立论。往在重庆，佑儿首为印行，销路颇佳，因此余亦得识翦君。”[1](第9册，P6767)[注]①1949年2月9日翦伯赞来访，见“翦君来访系今日事，误记于昨日(2月8日)”(第9册，第6768页)。 翦伯赞《中国通史》是金长佑主持的五十年代出版社承担印刷的，因而金毓黻、翦伯赞二人得以相识，由此得以近距离接触马克思主义史家。

YSGR=100%×(lnm1-lnm2)/t

冰冻组织样品取出后,按质量(g)∶体积(mL)=1∶ 9的比例,加入9倍体积的匀浆介质(生理盐水),冰水浴条件下机械匀浆,经低速离心(2 500 r/min,4 ℃,4 000×g)后,取上清液再用生理盐水按照1∶ 9稀释成1%组织匀浆用于谷胱甘肽-s转移酶活力测定。

Miseq文库构建及Miseq测序:通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端;使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物;Tris-HCl缓冲液洗脱,2%琼脂糖电泳检测;氢氧化钠变性,产生单链DNA片段。检测合格文库后,采用Miseq进行测序。

数据分析处理:采用Mothur软件将得到的 16S rDNA基因序列在RDP数据库中进行嵌合体检验,充分去除嵌合体序列。为了得到每个运算分类单元(OTU)对应的物种分类信息,采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的运算分类单元代表序列进行分类学分析,用Mothur软件构建稀释性曲线[16]。

1.5 对虾酶活分析

试验结束时,收获每个试验桶内对虾,并进行称重、计数。在每个试验桶内随机选取8尾对虾,取出完整的肝胰腺,装入离心管中后迅速浸入液氮罐中保存,然后带回试验室置于-80 ℃冰箱中保存备用。

这需要单位把长期投资方案的现金进行流出，然后把相关建设投资各年所获得的现金流入，该方法主要是利用相同时点的数值来进行表示，最后则需要进行对比分析。对相关数据进行对比分析的目的是为了能够了解到方案的经济性，从而把各方案的投资利益都归纳到客观的基础上。

1.6 对虾生长性能测定

试验结束时,将每个桶内收获记录的数据进行计算,包括存活率(SR,%)以及特定生长率(SGR,d/%)。计算公式如下:

XSR=100%×(n1/n2)

二是评价内容全面。评价内容除了纳税主体对税务工作人员的服务满意度以外，还应当加入其他能够覆盖税务办理业务各个环节、涉及税务业务办理的各个工作人员的评价指标，从而使得评价体系更为全面。

(1)

DNA抽提与PCR扩增:环境样品进行DNA抽提,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA,检测结束后进行PCR扩增,按照指定测定区域,合成带有barcode的特异引物(为保证后续数据分析的准确性及可靠性,需满足两个条件:尽可能使用低循环数扩增;保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预试验,确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。)

由于核心网网元之间的接口所涉及的链路，均通过核心网CE进行互联，对移动互联网的链路只需采集核心网CE与各个网元之间的链路，集采系统建议设置在核心网CE侧，如下图：

(2)

式中:XSR为存活率,%;YSGR为特定生长率,%/d;n1为试验结束时对虾存活尾数;n2为试验开始时投放的对虾尾数;m1为试验结束时对虾平均体质量,g;m2为试验开始时对虾平均体质量,g;t为养殖时间,d。

试验结束时,对每个生物絮团内水体进行抽滤,获得生物絮团样品,将滤膜置于-20 ℃保存,以备后续高通量测序分析,监测不同絮团处理组系统内的微生物群落变化以及优势菌群。

1.7 数据处理

利用Excel数据处理软件进行数据整理,用GraphPad 8.0进行图表数据处理,文中的数据使用SPSS 26.0软件进行分析,用平均值±标准差进行表示,通过单因素ANOVA和多重比较处理所得数据,以P<0.05作为差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 生物絮团养殖周期内的水体无机氮指标变化

图2为各个处理组及对照组在试验周期内亚硝酸盐氮水平变化。各个处理组在试验开始两周内亚硝酸盐氮质量浓度变化很小,在第13～25天,亚硝酸盐氮开始持续升高。在第25天,C_2_1组亚硝酸盐氮达到整个试验周期峰值(2.77±0.08 mg/L),25 d至试验结束,该组亚硝酸盐氮持续下降;对照组在开始1个月内亚硝酸盐氮质量浓度维持在1 mg/L以下,1个月后浓度持续上升;红糖组在试验周期内大体呈上升趋势;花生壳粉组在试验初期亚硝酸盐氮去除效果相较于红糖组差,但是到试验后期亚硝酸盐氮降低到了较低浓度水平;混合碳源处理组中亚硝酸盐氮去除效果最好的是C_2_1处理组,其次是C_1_1组,效果较差的是C_1_2组。

图1 各个处理组水体中氨氮(TAN)质量浓度变化Fig 1 Change of ammonia nitrogen(TAN) concentration in water of each treatment group

由图1可知,每个处理组的氨氮质量浓度在整个周期内大体呈先上升后下降的趋势,对照组在前期上升到7.48±0.45 mg/L后氨氮质量浓度开始下降,直至试验后期维持在3～4 mg/L;生物絮团处理组中,C_1_0组氨氮质量浓度达到试验最高水平(9.79±0.35 mg/L);C_0_1组的氨氮质量浓度始终维持在5 mg/L之下,氨氮去除效果较C_1_0组更明显;混合碳源处理组的C_2_1组氨氮水平在整个试验周期始终维持在较低水平,最高质量浓度仅2.43±0.45 mg/L,其次是C_1_1组,较差的是C_1_2组。综合结果显示