原花青素提取及分离纯化方法的研究进展

张媛雯，赵琳，郑天翔，陈语欣，谭伟

枣庄学院食品科学与制药工程学院（枣庄 277160）

原花青素（procyanidine，PC）是一类在植物中广泛存在的多酚化合物，是一种天然的抗氧化物。1961年首次从英国山楂新鲜果实中提取出该物质，至今已有40多年的历史[1]。原花青素是一类黄烷醇单体及其聚合体的多酚化合物，也称缩合单宁[2]，具有强有力的抗氧化、清除自由基能力，对人体微循环有特殊改善的双重功效，以高效、低毒、高生物利用率而著称[3]。科技的进步与消费者对食品感官要求的不断提高，推动了国内外研究者对原花青素分离、纯化领域的研究。该文主要对原花青素的提取、分离、纯化方法进行综述，旨为原花青素的产业化应用提供理论基础。

1 原花青素的提取方法

目前，国内外主要采用有机溶剂提取、超声波辅助提取、超临界CO2萃取、微波辅助提取及酶提取等方法提取原花青素。从操作难易程度、提取率、能源消耗、适用性等方面对5种方法进行对比，如表1所示。

1.1 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是依据不同成分在不同有机溶剂中溶解度不同的原理，将活性成分从原料中提取出来。因操作简便、设备简单等优点，有机溶剂提取法已实现工业化操作，但在提取过程中易造成热不稳定成分的破坏，同时存在有机溶剂使用量大、提取物杂质含量较高、污染环境等缺点。不同的研究者所用有机溶剂种类不同，提取率也有所不同。安鸣等[4]以废酒花为原料，分别用50%的乙醇与70%的丙酮提取原花青素，结果发现50%乙醇的提取量（45.36 mg/g）明显大于70%丙酮的提取量（21.94 mg/g）。只德贤等[5]用65%乙醇提取白刺果原花青素，得率平均值为17.289±0.402 mg/g。

1.2 超声波辅助提取法

超声波能够破碎植物细胞壁，便于溶剂进入细胞内，使植物中有效成分与溶剂结合，提高提取率[6]。该法具备高效、适用性广、提取率高且提取药液杂质少等优点，常与有机溶剂法共用。钱玉玲等[7]优化了蔓越莓原花青素的超声波辅助提取条件，以50%乙醇为提取溶剂，料液比1∶20（g/mL），70 ℃下提取40 min时，原花青素得率高达11.65%。谭永鹏等[8]以50%乙醇为提取剂提取黑枸杞中原花青素，当料液比1∶29（g/mL），220 W超声26 min时，原花青素得率为6.10%。

1.3 微波辅助提取法

在微波环境中提取活性成分，使目的组分加速溶出的同时不会造成活性成分的结构破坏[9]。该法提取效率高、热效率高，具有短时、节能、控制方便、对活性物质破坏小等[10-11]优点。张星和等[12]通过单因素试验和正交试验优化了火棘果原花青素提取工艺，采用85%乙醇，料液比1∶40（g/mL），560 W微波80 s，提取率最高为12.51 mg/g。Neto等[13]采用共晶溶剂（ESs）与微波辅助相结合的方式提取葡萄皮渣中的原花青素，不仅大大缩短提取时间，而且提高了提取得率和平均聚合度。李瑞丽等[14]以50%乙醇为提取剂，在料液比1∶6（g/mL），80 ℃微波处理20 min，葡萄籽原花青素的提取量为51.77 mg/g。在众多试验结果中，比较不同提取方法原花青素的提取率，微波辅助提取法所得原花青素提取率最高。

1.4 超临界二氧化碳萃取法

超临界二氧化碳萃取法通过控制温度和压力，改变超临界二氧化碳的密度和溶解能力，使它与待分离物质接触，有选择地把极性不同、沸点不同和分子量不同的成分萃取出来，然后通过减压升温，使超临界CO2变为气体，被萃取物质析出，从而达到了分离纯化的目的[15]。胡佳兴等[16]以甲醇为夹带剂从葡萄籽中萃取原花青素，在萃取压力32 MPa，萃取温度40 ℃，CO2流量为10 L/h的条件下萃取60 min，原花青素含量最高，为11.424 mg/g。颜雪琴等[17]以乙醇为夹带剂萃取石榴皮中的原花青素，当采用65%的乙醇、料液比1∶1.3（g/mL）、CO2流速为5 L/h、35 MPa下提取58 min时提取率为3.40%。该法适合萃取固态物质，溶解速率高、无毒无污染，但设备要求高，投资大，难以推广。

1.5 酶提取法

酶提取法主要是利用各种生物酶分解植物细胞壁，使细胞内活性物质扩散、溶解，可避免原花青素的活性遭到破坏。该法易于操作、条件温和、绿色无污染，是一项前景广阔的技术[18]。韩卓等[19]优化了紫薯原花青素的提取方法，在料液比1∶30（g/mL），pH为6.2，添加150 μg/mL纤维素酶，43 ℃下酶解65 min，原花青素提取率为5.039%。杨豆等[18]通过正交试验优化了果胶酶和纤维素酶提取葡萄籽中原花青素的提取工艺，在料液比1∶21（g/mL）、pH 5，添加1.0%的复合酶、50 ℃酶解60 min的条件下，所得提取率为3.805%。

2 原花青素的纯化分离方法

经提取后的原花青素仍含有多糖、黄酮类化合物、蛋白等杂质，需进一步分离纯化后，才能进行结构分析、功能性研究或工业应用。通过对多项分离纯化方法的应用与了解，总结了各类工艺的特点，见表2。

表2 分离纯化工艺特点

2.1 大孔树脂吸附法

大孔吸附树脂因其价格低廉、操作简便等特点，被广泛应用于天然植物活性成分的分离、纯化，在原花青素纯化研究领域应用最多。大孔树脂种类丰富，常用的有聚酰胺、ADS-17、AmberliteXAD-16、AB-8等。谭永鹏[20]用AB-8大孔树脂纯化黑枸杞原花青素，当上样量5 BV，上样流速2.0 mL/min，用50%乙醇洗脱，洗脱流速2.0 mL/min，洗脱量6 BV时，得到的原花青素纯度为86.75%。Musdzalifah等[21]将红高粱种子中的原花青素分别用大孔树脂D101和AB-8进行吸附分离，结果表明后者对原花青素有更高的吸附能力，其吸附容量可达34.65 mg/g，回收率为79.64%。伍勇等[22]从巨峰葡萄籽中提取原花青素后，用HPD-400大孔树脂纯化粗提液，上样流速为1.0 mL/min，用50%乙醇在pH 7.5的条件下洗脱，经纯化后的原花青素纯度可达94.17%。

经大孔树脂初步纯化后的原花青素仍含有较多杂质，纯度较低，因此还需再次进行纯化。纪秀凤等[23]采用HPD100大孔树脂对红树莓籽原花青素吸附后，分别用40%和60%的乙醇洗脱得到低聚原花青素、高聚原花青素，最后利用聚酰胺二次纯化，在最佳工艺条件（上样液体积100 mL，上样液2 mg/mL，上样流速1.5 mL/min，解吸流速1.5 mL/min，70%的乙醇作为解吸剂，解吸剂体积为150 mL）下，得到的低聚原花青素纯度为71.09%，较初步纯化纯度提高了18.73%。王丹阳[24]先用AB-8型大孔吸附树脂对葡萄籽原花青素进行初步纯化，纯度达77.34%，再利用Sephadex LH-20进一步纯化，洗脱液浓缩后原花青素含量为90.52%。

2.2 膜分离过滤法

膜分离技术兴起于20世纪初，于60年代发展为将物质分离提纯的新兴技术，是一种物理筛分技术。膜分离的种类有微滤（micro filtration，MF）、超滤（ultra filtration，UF）、纳滤（nano filtration，NF）、电渗析（electrodialysis，ED）、反渗透（reverse osmosis，RO）[25]。该技术绿色、高效、易操作，在水相溶剂中亦可使用，并不会发生相变。

陈文良等[26]采用微滤、超滤的膜分离技术分离纯化葡萄籽低聚原花青素，在1.0 MPa的操作压力下，选择10万道尔分子量规格的膜，制得产品的截留率最低，且低聚原花青素的含量较高。张娣等[27]用膜分离和树脂吸附相结合的方法纯化莲房原花青素，在最适宜工艺条件下超滤获得透过液，再用HZ-806树脂纯化，得到的原花青素纯度在81%以上，高于直接进行膜分离的原花青素纯度。Bazinet等[28]采用电渗析和超滤膜结合技术纯化浓缩红莓汁中的原花青素和花青素，两者总浓度分别提高了34.8%和52.9%。

膜分离技术在常温下进行，不会破坏物质结构，热敏性物质也可采用该技术。但其过滤设备价格高昂，生产成本高，难以工业推广。

2.3 凝胶色谱法

凝胶色谱法可用于原花青素提取液经初次纯化后进行进一步的分离纯化，提高纯度，与高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）联用，可进行结构鉴定。Tovopearl-HW-40、Sephadex LH-20和Sepherdex 75HR是常用的凝胶色谱填料。

Ling等[29]利用Me2CO/H2O萃取莲子房原花青素，Sephadex LH-20色谱柱进行纯化，得到纯度大于98%的产物。Kawahara等[30]使用Amberlite XAD-1180N、Toyopearl HW40F和Sepacore C-18反相闪蒸柱层析法，把红小豆的原花青素浓缩成5个馏分。Pedan等[31]通过Sephadex LH-20凝胶色谱柱，将原花青素B2和C1二聚体和三聚体成功分离。张驰等[32]用大孔树脂层析法分离纯化沙棘果中的原花青素时含量高达71.9%，该粗品经SephadexLH-20柱分离，50%乙醇作为流动相，可纯化至95%以上。杨雪娜[33]用Sephadex LH-20凝胶柱纯化从龙眼、冷撒果果皮中的原花青素，得到了高纯度的原花青素。

凝胶色谱法可以分离不同类型的原花青素，分离纯化效果最好，节省时间，提高效率，但其设备昂贵，维护成本高，投资大，不易推广。

2.4 高速逆流色谱法

高速逆流色谱技术（HSCCC）是依据化合物在不相溶两相间的分配能力不同，对植物中天然活性物质进行分离的液液分配色谱技术[34]。

Luo等[35]采用高速逆流色谱法对白葡萄皮中原花青素不同组分进行纯化，在3 mL/min流速、两相系统为己烷-乙酸乙酯-水、950 r/min转速的情况下，纯化后组分纯度可达90%以上。左春颖等[36]采用高速逆流色谱法将葡萄籽原花青素分离为6个组分，所得原花青素以高聚体为主要存在形式，低聚体占比少，总产率达85.1%。

高速逆流色谱技术是一种新兴的分离提纯技术，其避免了载体对提取物的污染和吸附，溶剂使用量少，同时具有高效、简便等优点，但设备成本高，不宜推广。

3 结语

原花青素具有广泛的生物活性，从天然植物中提取分离纯化原花青素，绿色、无公害，可用于药品、食品和化妆品等领域。与国外的研究相比，国内关于原花青素提取分离纯化的研究内容多样性、提取技术的先进性等方面仍稍有欠缺，因此，国内的原花青素仍有较高的研究价值。