拓木的防腐作用及其在薄片中的应用

韩航航，邓宝安，何媛，王芳，赵龙，张增辉

陕西中烟工业有限责任公司技术中心（西安 710065）

柘木，中药名，为桑科柘属植物柘树Maclura tricuspidataCarrière [Cudraniatricuspidata（Carr.）Bur. ex Lavallee]的木材。柘树分布于我国华东、中南、西南及河北、陕西、甘肃等地，具有滋养血脉，调益脾胃之功效[1-2]，主治虚损，妇女崩中血结，疟疾。拓木树叶富含活性物质，如黄酮、皂苷和多糖，并具有免疫调节、降血糖、防腐、抗炎、抗氧化和抗病毒活性[3-4]。然而，由于每年大量使用，拓木废物的处理成为严重的环境问题[5-6]。拓木树叶中含有丰富的活性物质。因此，可采取循环利用策略，促进拓木副产物的潜在创新应用和拓木资源的开发利用。

拓木黄酮作为一种重要的黄酮类化合物，是由植物、蔬菜和水果产生的一种次生代谢物，由2个苯环和酚羟基通过中心三碳链连接形成的一系列化合物组成[7-8]，已确定8 000余种黄酮类化合物。根据B环的连接位置、中心三碳链的氧化程度和环的形成的特征，拓木黄酮在许多植物的防腐、抗炎、抗癌、抗病毒糖尿病和抗氧化特性中发挥重要作用。

植物提取物（如黄酮）因其天然防腐、抗菌和抗氧化活性而被广泛研究，其在霉菌毒素污染和氧化酸败导致的食品变质中的应用研究被各国研究人员密切关注。据联合国粮农组织（FAO）统计，全球每年约有25%的谷物受到不同程度的真菌毒素污染，每年超过5 000万 t的谷物不能食用，直接经济损失达1 400亿美元。多种中毒症状可由人类或动物摄入被真菌毒素污染的农业和牲畜产品，以及吸入和皮肤接触真菌毒素引起。同时，酸败过程中产生的有害过氧化物和自由基会对人体健康造成严重危害，如炎症、衰老、过敏反应、癌症等发病率增加。防腐剂和抗氧化剂通常在食品加工、储存和保存过程中添加，以获得较长的保质期。合成防腐剂，如苯甲酸钠、丙酸钙和山梨酸钾等被广泛应用于薄片生产中；合成抗氧化剂，如丁基化羟基茴香醚（BHA）和丁基化羟基甲苯（BHT）被广泛应用于食品生产和加工中。然而，研究表明天然防腐剂（如黄酮）一般对人体无毒害，并能增加薄片的品质特征；合成抗氧化剂的广泛使用可能会导致肝损伤和癌症。试验通过评估拓木树叶作为食品防腐剂和抗氧化剂的天然来源生物活性，以鼓励循环利用并减少废物处理对环境的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

拓木树叶（采自中国张家口崇礼区拓木苗木种植农民专业合作社种植基地，将样品干燥并研磨成直径0.2~0.4 nm碎片）；马铃薯葡萄糖（PDA）、麦芽提取物（MEA）琼脂，均购自国药集团（上海）。电热鼓风干燥箱，上海一恒公司；AL2002电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；UV5紫外可见分光光度计，梅特勒-托利多仪器有限公司；使用的所有其他化学品和溶剂均为分析级。

1.2 提取和测定

总黄酮和皂苷的提取采用文献[9]的方法。在75%乙醇、液固比20∶1 mL/g、超声功率100 W条件下提取60 g拓木树叶干粉，测定总黄酮和皂苷含量。这个过程重复2次。旋转蒸发后，将粗提取物溶解在纯净水中，并用系统溶剂提取，得到石油醚（PEF）、乙酸乙酯（EAF）、正丁醇（BF）和水（AF）部分。用AB-8大孔树脂和不同体积分数的乙醇（0，30%，50%，70%和95%）分离和纯化EAF，50%乙醇洗脱液分离纯化所得物质为皂苷。用D101大孔树脂和不同体积分数的乙醇（0，30%，50%，70%和95%）分离纯化BF，50%乙醇洗脱液分离纯化得到的物质为总黄酮（0.169 g）。

采用水提醇沉法从拓木树叶中提取多糖。将拓木树叶的干燥粉末（5 g）用蒸馏水提取2 h。将提取物过滤并浓缩至20 mL，加入4倍体积的无水乙醇，并置于冰箱中过夜沉淀，获得粗多糖（0.747 g）。

用无水乙醇和无菌水将黄酮、皂苷和多糖溶解到100.0 mg/mL储备溶液中，通过二倍稀释法稀释至50×，25×，12.5×和6.25×。

1.3 抗真菌测试

试验使用的测试菌株黄曲霉、桔青霉、黑曲霉、串珠镰刀菌、米根霉和哈茨木霉为食源性致病菌。所有真菌在相应的培养基上于28 ℃培养48 h，并传代培养3次。PDA是桔青霉、黑曲霉、哈茨木霉和串珠镰孢的适宜培养基，MEA是黄曲霉和米曲霉的适宜培养基。

提取物的抗真菌活性采用菌丝生长速率法进行检测[8,10]。将不同的提取物与PDA/MEA培养基混合以获得质量浓度为10，5，2.5，1.25，0.625和0.312 5 mg/mL的固体板。PDA/MEA培养基为阳性对照，酮康唑为阴性对照。在28 ℃下培养真菌饼48 h后，计算菌落直径（d）。抑制率按式（1）计算。根据生物计量值转换机会表计算提取物的半最大有效浓度（EC50）和回归方程。

1.4 抗氧化活性测试

拓木树叶提取物（多糖、黄酮和皂苷）的自由基清除活性表示为DPPH和ABTS+自由基形成的抑制率。根据文献[10]的方法降低功率。使用浓度确定回归方程，并计算抑制率和EC50值。VC作为阳性对照。

1.5 黄酮含量分析

通过前期研究的方法测定提取液中的黄酮含量。因此，将测试溶液与不同体积的75%乙醇、5%亚硝酸钠、10%硝酸铝和4%氢氧化钠溶液混合，并孵育15 min。在波长510 nm处测量吸光度。通过芦丁的校准曲线计算黄酮含量（芦丁g/g样品）。

1.6 拓木黄酮类在薄片中的防腐应用

将PDA和MEA培养基按1︰1混合，分别将混合霉液定量加入含有化学防腐剂（0.1%苯甲酸钠）或5 mg/mL拓木黄酮类的烟草粉末中，摇匀后利用稠浆法制成薄片，置于37 ℃培养，定量取样，用平板菌落计数法测定活菌总数，并绘制曲线。

2 结果与讨论

2.1 抗真菌活性测定结果与分析

测试5种浓度（10，5，2.5，1.25和0.625 mg/mL）的黄酮、皂苷和多糖粗提物对黄曲霉、桔青霉、黑曲霉、串珠镰孢、米曲霉和哈茨木霉的抑制作用（图1）。图1显示，在测试的浓度范围内，与皂苷和多糖相比，黄酮类化合物表现出显著的抗真菌活性。用黄酮处理的真菌菌落的直径明显小于阴性对照的直径，从而表明黄酮类呈现潜在的抑制作用。ANOVA结果显示，不同提取物的5个浓度之间在P＜0.05时有显著差异。

图1 拓木树叶提取物的抗真菌活性

黄酮类化合物，尤其是对黄曲霉，在0.625 mg/mL时抑制率为56.66%，在测试浓度下表现出不同程度的抑制作用（图2）。此外，在5 mg/mL浓度下，对6种供试真菌的抑制率均达100%。结果表明，拓木树叶黄酮对供试真菌具有显著抑制活性。

图2 拓木树叶总黄酮的抗真菌活性

将拓木树叶黄酮的质量浓度和相应的抑制率分别转换为对数值和概率值，以获得毒性回归方程，并计算EC50（表1）。EC50是指引起50%最大效应的浓度，浓度低对应抑制作用强。黄酮类化合物对黄曲霉、桔青霉、黑曲霉、串珠镰孢、米曲霉和哈茨木霉的EC50分别为0.901 2，1.112 5，1.106 7，1.180 2，1.152 7和0.921 5 mg/mL。结果表明，拓木树叶黄酮抑制作用最强和最弱的真菌分别是黄曲霉和稻曲病菌。

表1 拓木树叶总黄酮对6种供试真菌的毒性回归方程及EC50值

2.2 抗氧化活性测定结果与分析

在DPPH、ABTS+和FRAP上测试5种浓度（5，2.5，1.25，0.625和0.312 5 mg/mL）的不同提取物的抗氧化活性（图3）。图3显示，黄酮类化合物和皂苷类化合物在测试的浓度范围内表现出显著的抗氧化活性。黄酮的DPPH、ABTS+和FRAP活性分别相当于1.25，5和1.25 mg/mL的维生素C。ANOVA结果显示，不同提取物的五个浓度之间存在0.005水平的显著差异。回归方程和EC50值列于表2。DPPH、ABTS+和FRAP黄酮的EC50分别为0.150 2，0.031 2和3.182 6 mg/mL。结果表明，拓木树叶黄酮具有显著的抗氧化活性。

表2 拓木树叶黄酮抗氧化活性的回归方程和EC50值

图3 拓木树叶提取物的抗氧化活性

活性导向分离是一种经济的技术，已被成功地用于鉴定、分离和纯化植物代谢物，这些代谢物具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤的特性。与粗提物相比，活性导向分离的馏分显示出更高的生物活性[7-10]。在抗氧化活性基础上，对拓木树叶总黄酮进行分离纯化，筛选出2种抗氧化活性较强的黄酮类化合物，即异槲皮苷和拓木甲苷。此外，植物源黄酮类化合物是一类天然产物，因其抗菌作用而受到广泛关注。有研究表明，植物来源的黄酮类化合物，如金盏菊和藏红花提取物，具有令人满意的抗真菌效果[9-10]。研究拓木树叶提取物对6种食源性真菌的抑制活性，阐明其在天然食品防腐剂开发中的潜在应用。

2.3 拓木黄酮类与化学防腐剂在薄片中抑菌防腐效果比较

由图4可知，在薄片中拓木黄酮添加量为5 mg/mL时能较好抑制黄曲霉和桔青霉等6种食源性致病菌的生长，其抑菌防腐效果明显优于0.1%的苯甲酸钠（P＜ 0.05），且在薄片中拓木黄酮类与化学防腐剂的抑菌防腐效果间的差异随着时间的延长而越明显。由于黄酮类化合物分子结构上含有较多的酚羟基，可与细胞膜上的蛋白质或酶类通过氢键方式结合，破坏蛋白质分子结构而变性甚至失去活性，导致细胞解体[11]。随着人们对食品安全和营养要求的提高，传统化学防腐剂的使用受到挑战，拓木黄酮类可以有效用于薄片的防腐保藏，延长其贮藏期，且不损害薄片的香味物质和品质，因此可将其作为食品天然防腐剂代替化学防腐剂苯甲酸钠或山梨酸钾。

图4 拓木黄酮类与化学防腐剂在薄片中抑菌防腐效果

3 结论

拓木是我国的一个药食同源物种，具有多种生物活性。试验评价拓木树叶作为食品天然防腐剂和抗氧化剂来源的再利用潜力。身体的新陈代谢产生许多活性氧（ROS）和活性氮（RNS）物质，它们对酶、蛋白质和DNA产生不利影响，从而引起生理失衡，最终导致许多疾病。抗氧化剂，如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）可清除体内的自由基。而一旦机体免疫力减弱或被有毒物质侵入，如Cd、Hg等，体内的抗氧化剂就无法彻底清除自由基，而摄入富含抗氧化剂的食物可以弥补这一不足。值得注意的是，人工抗氧化剂在食品工业中的广泛应用可能会导致肝损伤和癌症，而拓木黄酮类具有较好的抗氧化活性，因此可将其开发为绿色健康的抗氧化剂。拓木黄酮类对黄曲霉和桔青霉等6种食源性致病菌均有较好的抑制作用，其作用机制是通过破坏细胞膜结构和在细胞内产生大量ROS，致使细胞内发生明显的氧化应激而达到优良的抑菌效果，且拓木黄酮类抑菌防腐效果明显优于常用化学防腐剂苯甲酸钠。试验通过评估拓木树叶提取物的抗氧化和抗真菌活性和在薄片中的防腐效果应用，为从拓木副产品中开发天然抗氧化剂和防腐剂提供一种可能的创新应用，鼓励回收利用，减少废物处理对环境的影响，并可为从拓木树叶中开发天然食品抗氧化剂和防腐剂提供潜在的创新应用。