赤羽病诊断技术研究进展

李 超，王素春，王楷宬，薛 峰，王玉英

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室（南方），山东青岛 266032；2. 南京农业大学，江苏南京 210095；3. 青岛水族馆，山东青岛 266031）

赤羽病（Akabane disease ）又称阿卡斑病，是由赤羽病病毒（Akabane disease virus，AKAV）感染牛羊，以怀孕母畜流产、早产、产木乃伊胎，以及胎儿畸形、新生仔畜关节弯曲、积水性无脑症等为特征的一种虫媒传染病，蚊虫和库蠓是其主要传播媒介[1]。我国将牛赤羽病列为三类动物疫病[2]。牛赤羽病也是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的二类传染病，为口岸地区重点防范和检疫的外来动物疫病。近年来，邻近我国的韩国、日本赤羽病疫情频发，给当地牛羊养殖业造成了较大经济损失。随着全球化进程加快，动物及动物产品跨境流动频繁，AKAV通过牛羊及其产品进口等途径传入我国的风险不断增大。同时，蚊虫、库蠓等传播媒介的繁衍、增殖不再局限于特定区间，而是跨地区甚至跨洲流动，加上气候环境和生态系统变化以及极端天气增多，进一步加大了赤羽病传入我国并在国内传播和扩散风险。对赤羽病进行及时准确诊断是控制其传入、传播和流行的关键，因此需要加强对赤羽病防控技术的研究和储备。赤羽病诊断技术包括依靠观察病理变化的临床诊断以及依据实验室检测的病原学诊断和血清学诊断。本文对赤羽病诊断技术研究进展进行分析和综述，以期为建立赤羽病现场即时检测方法以及制定赤羽病诊断技术相关标准奠定基础。

1 临床诊断

1.1 临床症状

赤羽病临床症状主要表现为，牛羊流产、早产，产死胎、木乃伊胎，以及胎儿畸形、新生胎儿先天性关节弯曲等。本病在非怀孕牛羊中多为隐性感染，在成年牛中也可表现脑脊髓炎等临床症状。基因Ⅰ型AKAV可导致牛脑脊髓炎，基因Ⅱ型仅引起怀孕牛羊繁殖障碍[3]。

1.2 病理变化

AKAV对胎儿的脑、脊髓和肌肉细胞有感染组织嗜性，出现的非炎性坏死可干扰细胞多形性分化[4]。AKAV感染首先导致新生犊牛、羔羊出现共济失调，然后出现关节弯曲和肌肉发育不良，最终出现脑积水和严重神经系统病变。AKAV感染可造成神经和肌肉病变，如非化脓性脑脊髓炎、局部脑退化性脑脊髓炎造成的脑穿孔、小脑症、脑积水、腹角运动神经元和轴突消失、脊髓运动神经束髓磷脂减少，以及伴随骨骼肌薄壁组织退化的肌管坏死和多发性肌炎，脊髓病变导致的脊柱侧凸。同时，驼背和关节弯曲可能会影响全身所有骨骼关节[5]。用AKAV人工感染山羊和绵羊发现，感染羊出现关节弯曲、积水性无脑畸形、驼背、脊柱侧凸、头小和脑穿通畸形、产死胎和流产。AKAV自然感染绵羊胎儿，会导致围产期羔羊死亡或患先天性小脑症。用AKAV人工感染母牛后发现，其胎儿畸形种类与妊娠期有关，妊娠后76～104 d常见积水性无脑畸形，103～174 d多见关节弯曲[6]。绵羊由于妊娠期较短，被感染胎儿可同时出现脑和骨骼病变。

1.3 鉴别诊断

根据临床症状和病理变化可对赤羽病做出初步判断，发现可疑病例时应与可引起牛羊流产、早产、产死胎以及先天性胎儿畸形等临床症状的其他病毒（如施马伦贝格病毒、裂谷热病毒、蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病病毒等）感染做好鉴别诊断。

2 病原学诊断

2.1 病毒分离鉴定

病毒分离鉴定虽然是诊断赤羽病的“金标准”[7]，但在进出口检疫、动物疫病监测和流行病学调查过程中很少采用。主要原因：一是病毒分离鉴定耗时较长，效率不高；二是AKAV为单股负链分节段RNA病毒，相对于DNA病毒，其自身稳定性较差，容易失活，造成分离失败。研究[8]表明，从疑似患病动物采集肝素抗凝血进行病毒分离的成功率较高，偶尔也可从流产胎儿组织中分离到病毒。AKAV可引起鸡胚发育畸形，通过卵黄囊接种或乳鼠脑内接种可分离病毒，可通过患病毒血症的哨兵动物血浆或携带病毒的媒介生物白细胞中分离病毒，也可通过1～2日龄乳鼠脑内接种待检组织上清悬液分离病毒。常用哺乳动物传代细胞系如MDBK、Vero、BHK-21和HmLu-1细胞系在37 ℃培养条件下进行病毒分离，也可采用昆虫细胞C6/36在28 ℃培养条件下进行病毒分离[9]。一般需盲传3代，直至可见明显的细胞病变。可采用分子生物学试验、间接免疫荧光抗体试验、免疫组化试验或中和试验进行分离病原的鉴定。

2.2 免疫组织化学试验方法（immunohistochemistry，IHC）

IHC可采用胎牛和胎羊或用自然感染的新生小牛脊髓组织材料，用福尔马林固定，过氧化物酶染色后可进行AKAV抗原检测。免疫组织化学试验一般试验周期较长，不推荐用于基层现场赤羽病诊断。

2.3 反转录-聚合酶链式反应试验（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）

RT-PCR作为分子生物学方法中最简单的方法，在赤羽病日常诊断检测中应用较为广泛。AKAV的基因组由L、M、S3个基因片段组成，相较于L和M基因的多突变性，S基因相对保守，因此分子生物学方法一般将S基因作为AKAV核酸检测的靶标基因[10]。国内有不少研究已建立了成熟的RT-PCR方法，其检测限值可达1.0×109copies/μL，但与其他分子生物学检测方法相比，RT-PCR方法的敏感性略低且耗时较长。

2.4 荧光定量聚合酶链式反应试验方法（quantitative real-time PCR，qPCR）

qPCR具有操作简便、特异性强、敏感性高等优势，比普通RT-PCR灵敏度高且无需电泳检测，不仅能够保障人员的职业健康安全，还可减少核酸检测时间，是一种较为快速简便的赤羽病病原学检测技术。2015年，国家质量监督检验检疫总局发布实施了行业标准《赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法》（SN/T 3991—2014），首次将实时荧光RT-PCR（qRT-PCR）检测方法纳入赤羽病诊断技术范畴。马玲等[11]针对AKAV的S基因建立了SYBR Green I qRT-PCR方法，其检测限可达1.0×101copies/μL，同时具有较好的特异性和重复性，更适用于赤羽病传播媒介蚊虫、库蠓等病毒载量较低样品的病原检测。孟锦昕等[12]建立了AKAV qRT-PCR方法，其检测稀释的病毒标准品限值可达到10-8，具有较好的敏感性和特异性，为赤羽病的早期诊断提供了技术支持。

2.5 反转录-环介导等温扩增反应试验方法（reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）

RT-LAMP是具有独特扩增模式的一种可视化核酸检测方法，可肉眼直接判读反应结果，扩增反应可在等温条件下进行，不需要设备辅助，从核酸提取到结果判定，整个周期仅需1.5 h，检测成本低，使用简单，但其引物设计较为复杂。2018年，国家质量监督检验检疫总局发布实施了行业标准《牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法》（SN/T 4824—2017），首次将环介导等温扩增（LAMP）检测方法纳入赤羽病的标准检测方法。张吉红等[13]建立了AKAV RT-LAMP检测方法，其特异性良好，灵敏度可达11.5 copies/μL，采用SYBR Green I染色，肉眼即可判定检测结果。鱼海琼等[14]建立了RT-LAMP检测方法，其核酸检测的最低检测限为1.08 ng/μL，比RT-PCR灵敏度高出2个数量级。高峰等[16]利用LAMP技术的高特异性和敏感性等特点，尝试与微流控芯片技术相结合，基于LAMP技术，建立了包括AKAV在内的5种牛传染病病原的新型高通量快速检测基因芯片，其灵敏度可达102～105copies/μL，可实现高通量检测。

2.6 实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增试验方法（reverse transcription recombinase-aided amplification，RT-RAA）

RT-RAA可在常温条件下利用重组酶，在恒定温度下使引物和模板DNA发生链置换反应，反应时间低于30 min，并通过荧光判定结果，具有引物设计简单、反应时间短、特异性好、灵敏度高等优点。宋瑞鹏等[21]首次建立了AKAV荧光RT-RAA方法，42 ℃反应20 min即可快速检测出AKAV核酸，检测灵敏度可达6.26×101copies/μL，并且具有良好的特异性和重复性，为AKAV的现场快速即时检测提供了可靠方法。

2.7 聚类规则间隔的短回文重复序列-关联蛋白12a（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein，CRISPR-Cas12a）核酸检测试验方法

CRISPR-Cas12a核酸检测试验方法采用CRISPR/Cas12a系统，联合便携式检测试剂条、便携式荧光可视化系统或者超灵敏荧光传感系统等生物传感器，在满足高敏感性和高特异性的同时具备了检测高效、便捷的特点。一般须结合RT-RAA或者RT-LAMP技术进行核酸预扩增，相较于传统AKAV核酸检测技术，基于CRISPR/Cas12a技术的核酸检测系统具有较多优势：操作简单且便携，不依赖于昂贵的设备和严苛的实验条件，操作便捷的同时可达到理想的灵敏度和特异性，检测所需时间较短，结果读取简单方便，通过荧光信号或肉眼即可进行结果读取，相应试剂可以冻干粉形式存放，便于保存和携带。基于CRISPR/Cas12a的AKAV荧光检测方法在国内尚属于研究空白。唐浩等[17]基于CRISPR/Cas12a技术结合反转录-环介导等温扩增试验方法（RT-LAMP）建立了一种便携式检测新型布尼亚病毒方法，其最低检测限可达25 copies/μL，在试纸条上显示肉眼可见的信号，可在2 h内可实现对新型布尼亚病毒的核酸检测。

3 血清学诊断

3.1 胶体金免疫层析试验方法（colloidalgold immunochromatography assay，GICA）

GICA以抗原抗体的特异性反应原理为基础，以胶体金作为示踪标记物或显色剂，检测时间通常只需10 min左右，且不需要设备和人员培训，其缺点是检测灵敏度比分子生物学方法要低，仅可用于辅助诊断。孔玉方等[18]研制的牛赤羽病血清抗体胶体金检测试纸，检测灵敏度达1:512，特异性较好，仅可与AKAV 的N蛋白抗体牛血清反应，可用于基层养殖户的赤羽病初筛。杨素等[19]采用双抗体夹心免疫层析技术，研制了适合田间快速试验的AKAV胶体金免疫层析试纸条，其检测限可达10 TCID50，特异性较强，还具有快速、稳定、简便等优点，可用于赤羽病的大批量、田间快速初筛和现场快速诊断。

3.2 血清中和试验方法（serum neutrlization test，SNT）

SNT是依据抗原抗体特异性反应原理，将待检牛羊血清按比例稀释后，与确定含量的AKAV混合、孵育，作用一段时间后再接种到AKAV敏感细胞内（如BHK-21或MDBK细胞），通过观察细胞病变（cytopathic effect，CPE）来判定血清阳性与否的血清学检测方法。SNT特异性高，其缺点是容易受抗原纯度、抗体效价和标准阳性血清质量影响，需要制备标准阳性血清和微量病毒中和试验抗原，且检测时间较长，试验成功的关键是抗原和标准阳性血清的质量。SNT是确定AKAV抗体阳性血清的标准方法。2002年农业部发布实施农业行业标准《赤羽病细胞微量中和试验方法》（NY/T 549—2002），2007年SNT被列入《赤羽病检疫技术规范》（SN/T 1128—2007）中。

3.3 琼脂凝胶免疫扩散试验方法（agar gel immunodiffusion test，AGID）

AGID依据抗原抗体特异性反应原理，运用已知的AKAV抗原来检测待检样品中的AKAV血清抗体，其操作简便快速，尤其适应于大量血清样品的检测，但其特异性较差，敏感性也较低，易出现假阳性问题，需要AKAV抗原和标准阳性血清[20]。该方法作为一种赤羽病辅助诊断的血清学检测方法，被列入《赤羽病检疫技术规范》（SN/T 1128—2007）中。

3.4 酶联免疫吸附试验方法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA既可以用来检测AKAV抗原，也可以检测AKAV抗体。因现阶段我国尚无赤羽病相关疫苗可用，因此不管是AKAV抗原阳性还是抗体阳性结果均可正确、快速诊断赤羽病。在商品化诊断试剂方面，法国ID-Vet公司研发的ID Screen AKAV抗体检测试剂盒[21-22]，是以纯化的AKAV为包被抗原，以抗AKAV囊膜蛋白的单克隆抗体为竞争抗体所建立的竞争法酶联免疫吸附试验试剂盒，其敏感性可达96.52%，特异性可达98.83%，能够实现与施马伦贝格病毒血清的鉴别检测，是目前公认的敏感性高、特异性强的AKAV抗体检测试剂盒，被广泛应用于牛羊血清中的AKAV抗体检测和赤羽病诊断。国内也有不少单位正在进行AKAV ELISA试剂盒的研发工作。陈冬杰等[23]利用表达纯化的N重组蛋白作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的抗N蛋白单克隆抗体为竞争性抗体，通过对反应条件不断优化，最终建立了AKAV N蛋白竞争ELISA抗体检测方法。该方法采用N蛋白作为标准抗原包被酶标板，可避免采用AKAV全病毒作为标准抗原包被酶标板时，因灭活不彻底而产生的生物安全隐患，同时保留了检测方法的敏感性和特异性[24]，为目前国内临床上赤羽病血清学监测提供了技术手段。王建华等[25]采用表达的AKAV重组截断囊膜蛋白（第407～614位氨基酸）包被酶标板，优化反应条件建立了AKAV间接ELISA方法。该方法具有良好的特异性和重复性，对1:1 280稀释的AKAV阳性血清仍可检测出阳性；针对同样样品盘，该间接ELISA方法的阳性检出率要高于SNT，但低于ID Screen AKAV抗体检测试剂盒。间接ELISA方法的建立为血清样品中AKAV抗体检测提供了有效手段。

4 展望

AKAV是正布尼亚病毒属中最重要的病原体，可在蚊虫、库蠓的肠道或唾液腺中复制，蚊虫、库蠓叮咬健康牛羊后，可将病毒通过血液传播给新宿主，因此蚊虫和库蠓不属于机械性传播媒介。牛在发生病毒血症3～4 d后出现血清转化，可检测到AKAV抗体[26]。赤羽病暴发可对当地畜牧业造成较大经济损失，其暴发条件包括易感动物处于怀孕早期，某地区传播媒介物数量激增（特别是在病毒已消失数年时）、降雨量激增等情况[27]。在赤羽病流行地区，高水平的母源抗体可防止胎儿被感染，但AKAV可在牛羊胎盘中长期持续性感染，一般发生在母羊妊娠后30～70 d及母牛妊娠后30～150 d[28]。当牛羊出现关节弯曲和积水性无脑畸形等上述临床症状和病理变化时，牛群和羊群发病率较高，传播迅速，可判定为疑似赤羽病，但最终确诊需要依靠实验室诊断。

赤羽病的实验室诊断技术主要包括病原学诊断和血清学诊断，其中病原学诊断主要检测AKAV抗原或核酸，血清学诊断主要检测牛羊血清中是否存在AKAV特异性抗体[29]。赤羽病是我国口岸重点监测的跨境动物疫病，其实验室检测依据行业标准《赤羽病检疫技术规范》（SN/T 1128—2007）、《赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法》（SN/T 3991—2014）和《牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法》（SN/T 4824—2017）等。其中ELISA方法是我国检疫进口牛羊赤羽病常用的血清学检测方法[30]。但现阶段我国对进境牛羊赤羽病检疫严重依赖国外进口抗体检测试剂盒，检疫单头份成本高。因此，开展赤羽病新型诊断技术和检测方法研究，开发新的简便、易行，具有高度特异性和敏感性，结果判定标准化，且适宜于大规模筛查的赤羽病检测方法，研制相应的赤羽病诊断试剂，对于提高赤羽病的检疫和监测能力具有重要的实际意义[31]。

AKAV因其特殊的传播途径及感染方式，导致多数感染动物为隐性感染，不利于早期感染诊断，这大大增加了赤羽病防控难度。因此，除了研发特异性强、敏感性高的诊断试剂外，还要做好赤羽病疫苗的相关技术储备。当赤羽病形成暴发和流行时，疫苗可提供有效免疫屏障[32]。目前我国尚未系统开展家畜AKAV感染的持续性监测工作，下一步应加强赤羽病的流行病学调查和监测预警。此外，还需要即时修订赤羽病诊断相关技术标准，制定赤羽病暴发调查技术规范[33]，以满足我国赤羽病防控的实际需要。