MutL 调控水稻黄单胞菌的致病力

米 多，陈 雨，邢 芸，陈银华，陶 均，李春霞

（海南大学 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/热带作物学院，海口 570228）

DNA 是大多数生物的遗传信息载体，是保证物种延续性的基础，微小的变化都可能对细胞产生致命的影响[1]。在生命进化的过程中，DNA 一直受到外界环境和内部因素的影响。细胞中dNTPs 和rNTPs 浓度改变、DNA 聚合酶保真性变化和外界环境改变都可能导致高突变率和非完全同源DNA 序列之间的重组能力增加，进而影响基因组的稳定性[2]。DNA 错配修复（mismatch repair，MMR）系统可以纠正复制和重组过程中发生的DNA 碱基错配，确保染色体复制的精确性和维持基因组的稳定性[3]。

MutL/MutS 是原核生物最重要的MMR 系统。DNA 错 配 修 复 蛋 白 MutL 羧 基 端 含MLH1 和PMS2 二聚体结构域，其中PMS2 具有内切酶活性；MutL 氨基端具有ATP 酶和DNA 结合活性[4-6]。当MMR 复合体中的另一个关键蛋白MutS 识别并结合到发生碱基错配位点时，其构象发生变化，招募MutL 形成修复复合体，对错配序列进行修复[7-8]。

在大肠杆菌中，MutL 发挥内切酶作用，在错配位置产生切口[9]，阻断DNA 链继续合成。MutL 的DNA 结合位点突变会使MutL 无法结合在发生错误的DNA 位点，MMR 系统不能发挥正常功能，活性下降，错配序列无法修复，显著提高细菌的突变率[10-12]。在铜绿假单胞菌中，MutL 也具有DNA 切割活性，使发生错配的DNA 双链断裂，然后通过非同源端连接进行DNA 修复。非同源端连接将提高染色体缺失的可能性，染色体的缺失导致铜绿假单胞菌产生棕色突变体，这种颜色的突变体可以防止噬菌体捕食[13]。在人和多数模式生物中，MutL 的功能已有广泛研究[14-16]，但其是否与病原菌的致病性相关还未见报道。

白叶枯病是影响水稻生产最严重的细菌性病害，由水稻黄单胞菌白叶枯致病变种（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）侵染所致[17]。Xoo致病力受很多因素调控，调控途径也不相同，不同途径间还有相互影响，是外界环境和内在因素共同作用的结果[18]。目前的研究表明，基础代谢、外源信号感应与传递、分泌系统及其分泌蛋白是调控Xoo致病力的关键因素[19-20]。Xoo侵染水稻时，水稻会产生防卫反应，产生大量有毒的物质如活性氧等毒害病原菌[18]，导致其突变增加，生存受到挑战[19]。病原菌要成功侵染必须要有高效的应对措施。DNA 损伤修复是保证病原菌应对外界环境不利影响的重要措施之一[9]。因此，MMR 应该在此过程中起到非常重要的作用，但相关研究还未见报道。本实验研究MutL 是否参与XooDNA 错误修复以及是否调控病原菌的致病力，旨在为白叶枯病的防治提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒PXO99A菌株和pK18mobSacB质粒为笔者所在的实验室保存，大肠杆菌菌株购自全式金生物技术有限公司。

1.2 培养基与试剂PSA 培养基：1%胰蛋白胨、1%蔗糖、0.1%谷氨酸钠；PGA 培养基：1%胰蛋白胨、1%葡萄糖、0.1% 谷氨酸钠；PSSU 培养基：1%胰蛋白胨、15%蔗糖、0.1%谷氨酸钠；LB 培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl；M4M 培养基：0.048% Na2HPO4、0.03% KH2PO4、0.05%柠檬酸钠、0.1% (NH4)2SO4、0.05%酶水解酪素、0.02% MgSO4·7H2O、0.05%葡萄糖。固体培养基另加1.5%的琼脂。DNA 凝胶回收及质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。高保真DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶及T4 连接酶购自NEB 公司。其他试剂购自广州化学试剂公司。

1.3 引物设计与合成根据基因两端序列，运用软件Primer 5 分析、设计引物（表1），并由生工生物工程（广州）分公司合成。

表1 本实验引物

1.4 mutL 突变体的构建及致病力检测PCR 扩增mutL上下游各约500 bp 序列，分别用HindIII/BamHI 和BamHI/EcoRI 酶切后一起连接到经HindIII/EcoRI 酶切的自杀性载体pK18mobSacB上，热激法转化大肠杆菌，获得pK18-mutL载体，测序正确后采用同源重组、两次交换的方法构建突变体。采取剪叶法，在TP309 水稻叶片上接种野生型菌株PXO99A和mutL突变体，14 d 后量取从剪口处到枯斑内部边界的长度，统计病斑长度与数量。

1.5 检测Xoo 生长速度

1.5.1生长曲线的测定PXO99A、△mutL菌株培养（PSA 培养基、28 ℃、180 r·min-1）36 h 后，按1∶100 转接于10 mL PSA 中，用全自动微生物生长曲线分析仪每2 h 测定1 次OD600值。

1.5.2在缺陷培养基上的生长情况将PXO99A、ΔmutL菌株用PSA 培养36 h，M4M 培养基清洗2 遍，调至OD600=1.0，再稀释至10-7共8 个梯度，取2 μL 菌悬液点板（PSA 和M4M 固体培养基）28 ℃倒置培养，2～3 d 拍照。

1.6 H2O2 诱导情况下Xoo突变率的测定PXO99A、ΔmutL菌株用PSA 培养36 h 后，1∶100转接于500 mL PSA 中，待培养到对数生长期，ddH2O 清洗1 次，调OD600=1.0，取相同体积菌液，用终浓度40 mmol·L-1的H2O2处理菌液30 min，ddH2O 清洗过氧化氢2 遍，最后用6 mL ddH2O 重悬，取出100 μL 菌液稀释到10-7、10-8后，稀释液涂PSA 平板，计算菌落总数（A）；其余菌液（5.9 mL）涂布于PSA 加利福平的平板上，28 ℃ 培养3 d，统计菌落数（B）。B 与A 的比值即为突变率。

1.7 互补菌株的构建PCR 扩增全长mutL，产物回收后无缝克隆到HindIII/EcoRI 酶切的广宿主载体pHM1 上。PCR 验证转化大肠杆菌获得的单菌落，对阳性克隆进行测序分析。测序正确的质粒用电击法转入到ΔmutL，获得互补菌株（C-ΔmutL）。

2 结果与分析

2.1 mutL 缺失突变导致Xoo致病力下降以PXO99A为野生型菌株，经过2 次同源重组后mutL基因被缺失突变。以mutL两侧引物进行PCR，以PXO99A和ddH2O 作对照。如图1-A 所示，mutL突变体的扩增片段比野生型扩增片段短，约1 800 bp，正好符合mutL基因片段大小（1 878 bp），表明mutL突变体（ΔmutL）构建成功。为了进一步分析mutL的功能，构建了mutL的互补菌株C-ΔmutL。将PXO99A、mutL突变体及其互补菌株接种TP309 水稻，结果显示mutL突变体的病斑长度比野生型及其互补菌株都短，野生型和互补菌株间没有显著差异（图1-B、C）。说明mutL正调控Xoo的致病力。

图1 mutL 突变体的构建及其致病力分析

2.2 mutL 突变并不显著影响Xoo的生长MutL的功能是对细胞DNA 错配进行修复，维持细胞生命活动的正常进行，其突变可能改变其生长。因此，本研究检测了mutL突变是否影响Xoo的生长速度。结果显示，在丰富性培养基(PSA)和营养营养缺陷型培养基（M4M）中，ΔmutL的生长速率都略低于PXO99A（图2- A 和图2-B），但没有显著差异。说明MutL 在正常情况下并不显著影响Xoo的生长。

2.3 MutL 参与XooDNA的应急修复H2O2是常见的活性氧种类，与二价铁离子发生Fenton反应，反应产物中的羟自由基具有极强的氧化能力，会对DNA 产生损伤。细胞MMR 系统可以修复损伤DNA，使其遗传稳定。但突变mutL后，MMR 系统受损，细胞DNA 修复功能会减弱，可能增加细菌的突变率。突变率通常采用菌株利福平抗性获得率来表示[19]。因此，将对数生长期的野生型PXO99A和ΔmutL菌株进行H2O2胁迫处理，然后涂布在含利福平的平板上生长。3 d 后的统计结果显示，与PXO99A相比，△mutL的突变率显著增加(图2- C)，说明MutL参与Xoo的DNA 修复。

图2 MutL 对Xoo 生长和突变修复的调控作用

3 讨 论

在病原菌侵染过程中，病菌自身会改变其代谢活性、毒素合成和分泌能力等，逃避宿主攻击[18-20]。同时宿主在对抗病原菌时也会产生多种防御机制[21]。其中快速产生活性氧（ROS）限制细菌生长繁殖是植物普遍的防御机制[21]。细菌成功侵染必须要快速适应这种高ROS 环境。一方面，病原菌在感染植物过程中会诱发ROS 清除酶表达，进而清除ROS；另一方面，细菌会修复由ROS 带来的损伤，包括DNA 和其他大分子物质，帮助病原菌适应宿主环境并成功繁殖[21]。因此，DNA 损伤修复对病原菌成功侵染是重要的。在细菌中，MutL/MutS 系统是主要的修复系统，其突变将导致细菌自发突变率增加、抗逆性降低、环境适应能力减弱[3]。对病原菌而言，MutL/MutS 可能对病原菌适应宿主体内环境起到重要的作用。

本研究结果表明，mutL突变导致Xoo在水稻TP309 上的致病力降低（图1)，说明MutL 调控Xoo的侵染过程，是Xoo致病性相关的调节因子。同时，在正常条件下（无论是在丰富型还是营养缺陷型培养基中），mutL突变都未显著改变Xoo的生长状况（图2），说明MutL 可能不是直接调控细菌生长来影响其致病力的。如前所述，在侵染过程中植物会释放大量ROS 对细菌生长和DNA 造成损伤[21]。本研究结果也显示，ROS 增多导致mutL突变体的突变率急剧增加（图2）。这暗示MutL 调控Xoo致病力可能是由于其修复DNA 能力降低导致的，但具体机制还需进一步研究。

在大肠杆菌中，mutL突变后自发突变率比野生型高300 倍[22]。分支杆菌mutL突变也导致自发突变率增加4 倍[23]。同样，缺失mutL的耐辐射奇球菌的自发突变率也增加了16 倍[24]。然而，本研究在Xoo中并未检测到野生型和mutL突变体自发突变率的差异，暗示Xoo中可能存在其他主要的DNA 修复系统，而MutL 是否只有在逆境环境中才发挥功能，需进一步研究证实。