内质网应激-自噬在皮瓣缺血再灌注损伤中的作用及中药干预

朱克玉，宋渊*，沈稼轩，乔靖，韩潇，王恒杰

（1 甘肃中医药大学，兰州 730030；2 甘肃省中医院，兰州 730050）

随着工业和农业化进程，复杂的手工操作，各类软组织缺损伤逐渐增多。一期闭合伤口，降低感染率，恢复其良好的外形及功能是一个难题。皮瓣移植技术是解决此类损伤最常用、最有效的办法。缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion, I/R）是造成皮瓣移植术后皮瓣坏死的主要原因，是皮瓣从供区转移至创面的过程中，组织经历缺血、重新获得血液灌注或供氧后所产生的一系列损伤[1]。皮瓣坏死后需行复杂的重建修复手术，给患者带来心理负担和经济负担[2]。目前研究发现I/R 的主要病理机制有炎症反应、氧化应激、钙超载、铁死亡、细胞凋亡等[3]。这些体外或体内应激性刺激造成内质网腔的强氧化环境被破坏，导致内质网功能出现障碍，产生突变的蛋白质或者蛋白质二硫键不能形成，引起内质网中未折叠或错误折叠蛋白的积聚，诱发内质网应激 （endoplasmic reticulum stress, ERS)[4]。细胞为了消除内质网中积聚的未折叠或错误折叠的蛋白启动未折叠蛋白反应（unfloded protein response,UPR）[5]。细胞自噬是伴随UPR 发生的另一种细胞保护机制, 帮助降解内质网中积聚的未折叠或错误折叠蛋白，降低ERS，维持内质网定性，保护细胞存活[6,7]。近年来研究表明[8,10]，I/R 与ERS 诱导的自噬密切相关，中医药干预ERS-自噬成为防治I/R 损伤的新方法。本文就近年来关于该方面的研究进展作一综述，旨在为I/R 防治寻找新的潜在干预靶点。

1 内质网应激与自噬

内质网在真核细胞内具有重要的生理功能，能协调蛋白质折叠，脂质合成和钙储存与释放，具有很强的活跃性，当受到缺血缺氧、未折叠或错误折叠蛋白质在内质网中大量堆积、Ca2+平衡破坏、蛋白质糖基化抑制等内源或外源因素刺激时均可导致内质网的功能受损，从而引起ERS[11]。细胞自噬是真核生物进化过程中高度保守的一类降解途径，通过自噬体将蛋白质等生物大分子、线粒体等细胞器以及微生物等回收至溶酶体形成自噬溶酶体，再降解为氨基酸、单糖等小分子，实现物质循环再利用的动态过程[12]，因此，ERS 和细胞自噬是两个独立的生物过程。越来越多的研究表明[13,14]，二者存在相互作用，ERS 可引发自噬，自噬通过降解积聚的错误折叠蛋白质来减轻内质网压力。当ERS 持续较长时间时，内质网功能紊乱，细胞激活UPR 信号通路以应对环境变化，恢复利于蛋白质折叠的内质网环境，维持细胞内环境稳定。若ERS 不能逆转，UPR 激活细胞自噬甚至诱发细胞凋亡，以实现内环境的稳定[15]。葡萄糖调控蛋白（glucose-regulated protein78, GRP78）作为ERS 标志蛋白，对于ERS 诱导自噬发生非常重要，在发生ERS 时，GRP78 的表达量显著增高，大量积聚的错误折叠或未折叠蛋白优先与GRP78 结合，导致GRP78 与UPR 的类PKR 的内质网激酶（PKRlike endoplasmic reticulum kinase, PERK）、肌醇需求激酶1α（inositol requiring enzyme 1α, IRE1α）、转录激活因子6（activating transcription factor-6, ATF6）3种感受器分离，激活UPR 信号转导途径，促进蛋白质正确折叠和错误折叠蛋白降解，以恢复内质网环境的稳定[16,17]。可见，ERS 和细胞自噬是细胞在程度不同的刺激因素下产生的适应性反应，二者相互作用，共同调节细胞命运。轻度的ERS 引起的UPR是一种防御机制，维护细胞和机体的稳态。持续发生的ERS 则能诱导细胞自噬，发挥类似UPR 的补充机制，进一步降解异常蛋白质和受损的内质网等细胞器，并通过负反馈机制抑制ERS，减弱环境刺激对细胞的影响，维持细胞稳态[18]。

2 内质网应激在缺血/再灌注损伤中的作用

I/R 是皮瓣不可避免的一个极其复杂的病理、生理过程，其机制包括缺血和再灌注两部分[19]。缺血过程会导致三磷酸腺苷（ATP）减少、细胞内代谢性酸中毒、线粒体和细胞内钙超载等；再灌注过程会引起活性氧、氧化应激、炎性反应、自身免疫反应等[20,21]。因此，全面认识I/R 的机制，寻找多方法、多渠道的干预措施才能预防和治疗I/R 损伤，并能减少皮瓣术后的并发症[22]。研究表明[23]ERS 参与I/R损伤过程，ERS 预处理可以提高组织缺血再灌注损伤的耐受性，其可能的效应机制[24,25]：一方面，上调GRP78 蛋白表达增强内质网处理未折叠蛋白能力；另一方面，抑制 CHOP 信号途径激活，减少细胞凋亡、减轻组织炎性反应。GRP78 和CHOP 是内质网应激途径的两个经典标志物[26]。ERS 早期，细胞通过启动未折叠蛋白反应特异信号系统，促使GRP78表达上调，并与内质网中错误折叠的和未折叠的蛋白结合，恢复蛋白质正确构象，维持内环境稳定。但在过久的ERS 情况下CHOP 被大量诱导表达，从而启动CHOP 介导的细胞调亡[27]。因此，通过抑制ERS 反应，可以有效预防细胞凋亡，使I/R 病理进程得到抑制。以上研究提示以ERS 为干预靶点，可能为阻断皮瓣缺血诱导I/R 损伤提供一种新方法。

3 自噬在缺血/再灌注损伤中的作用

自噬是细胞在溶酶体内消化细胞质的现象，其主要功能是清除和回收错误折叠或损坏的蛋白质和细胞器，这与细胞的存活和凋亡密切相关[28]。自噬是一把“双刃剑”，在皮瓣缺血阶段，自噬降解非功能性胞质蛋白，为关键生命活动提供关键营养，从而抑制细胞凋亡和坏死[29]。最新研究表明[30]，自噬是减少缺血后损害的必要条件，自噬过程可通过去除受损的线粒体来限制NLRP3 炎性小体（inflammasome）的活化。但是，过度自噬在再灌注阶段可能会对皮瓣产生负面影响。研究显示[31]，中药可能通过缺血期诱导自噬发生，再灌注期抑制自噬来发挥抗I/R 损伤的作用。I/R 通过抑制自噬体的形成，导致氧化应激和细胞凋亡增加[32]。因此，自噬是I/R损伤的重要病理机制之一，利用自噬的双重作用及特点和功能，通过药物干预细胞自噬，进而抑制炎症、细胞凋亡和氧化应激，促进皮瓣成活，可能是未来防治皮瓣I/R 损伤的主要策略。

4 中药干预内质网应激-自噬防治I/R 损伤

近年来随着I/R 损伤相关研究的不断深入，中药单体、提取物及复方通过干预内质网-自噬相关因子的表达，提高皮瓣成活率成为相关领域的研究热点。中药以其多靶点、效应广，副作用少等优势在I/R 损伤治疗药物中的地位日益提高。随着分子生物学技术的成熟，其治疗机制研究也日益增多。本部分总结近年来内质网标志细胞因子GRP78、CHOP，自噬相关研究的热点或关键作用的细胞因子LC-3、beclin-1、mTOR 和P62，以及中药的调控作用与机制。

4.1 中药干预内质网应激

4.1.1 中药单体和中药

Pan 等[33]研究发现白藜芦醇可以上调GRP78，下调p-PERK 和CHOP 蛋白的表达，促进内质网结构和功能的恢复，减轻细胞损伤，从而减轻I/R 损伤。代小兰等[34]发现白芍总苷干预能够显著降低大鼠脑组织GRP78、p-PERK、CHOP、NF-κB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 蛋白表达，抑制过度ERS 介导达到抑制细胞凋亡，对I/R 损伤起保护作用[35,36]。实验表明，香叶醇降低ERS 相关蛋白PPERK、ATF4、CHOP 和GRP78 和促凋亡蛋白BAX的表达，增加抗凋亡蛋白BCL-2 的表达，减少细胞凋亡，减轻I/R 损伤[37]；柚皮苷显著抑制 GRP78、CHOP、Caspase-12 和ATF6 蛋白的表达，对I/R 引起的ERS 具有抑制作用[38]；绞股蓝苷XVII 显著降低GRP78、ATF6、CHOP 的表达和PERK 的磷酸化，对ERS 具有抑制作用[39]；黄芪素下调ERS 相关蛋白GRP78 及其下游凋亡介质CHOP 和Caspase-12的表达水平，防止I/R 诱导的损伤[40]；川芷素预处理显著下调ERS 相关信号分子GRP78，CHOP 和caspase-12 蛋白质水平，上调p-PI3K 和p-AKT 的水平，减轻I/R 引起的损伤[41]；龙血竭灌注可以上调BCL-2 蛋白表达，下调Bax、GRP78、CHOP-1、p-P38、p-JNK-1、pERK 蛋白的表达，减少细胞凋亡，抑制ERS，进而达到抗I/R 损伤的作用[42]。

4.1.2 中药复方

补阳还五汤是清代名医王清任的经典方。具有补气活血通络之功效。程一升等[43]通过实验发现补阳还五汤可下调GRP78、PERK、elF2α、ATG12等内质网应激-自噬相关基因的表达改善缺血再灌注损伤。清热活血汤由黄芩、丹参、赤芍、川芎、红花等组成，具有清热解毒、活血化瘀之效。李睿等[44]研究发现清热活血汤下调Bax /Bcl-2、GRP78、CHOP、P62 的表达，同时上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、FAM134B 蛋白表达，抑制内质网应激及其凋亡通路激活，减轻组织损伤。《金匮要略》中栝蒌桂枝汤具有抗炎、抗氧化应激的作用[45]，可以减少氧化应激、促进Ca2+动态平衡来抑制I/R 损伤引起的ERS与细胞凋亡[46]。陈喆鸣等[47]发现栝蒌桂枝汤治疗后可明显下调 GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3，上调Bcl-2 mRNA 的表达，下调ERS 水平，抑制下游凋亡通路的传导而发挥治疗I/R 作用。加味益气通玄方由黄芪、当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙、水蛭、全蝎九味中药组成，彭艳等[48]实验研究发现加味益气通玄方可以通过抑制GRP78、caspase12 和CHOP 的表达，抑制内质网应激介导的细胞凋亡。

4.2 中药干预自噬

4.2.1 中药单体

有研究发现，黄芪甲苷促进细胞活力并平衡Bcl-2 和Bax 表达，降低细胞凋亡率，降低P62 表达，增加LC3II / LC3I 表达，表明黄芪甲苷通过促进自噬程度来下调细胞凋亡，对I/R 损伤起保护作用[49]。实验证实，葛根素预处理降低beclin-1 的表达和LC3-II/LC3-I 比率，以及p-AMPK 和pS317-ULK1水平，相较之下增加p62、mTOR 和pS757-ULK1 的表达水平，抑制I/R 诱导的自噬，治疗I/R 损伤[50]。再灌注后beclin1、LC3 和P62 表达升高，细胞自噬增加；川芎嗪干预后beclin1、LC3 和P62 蛋白表达相对降低，表明川芎嗪可能对细胞自噬有抑制或调节作用[51]。松香素能降低LC3II 和Beclin1 的表达，并增加p62 的水平，减少I/R 大鼠细胞自噬的过度激活[52]。在天麻素预处理的细胞模型中，LC3II 的表达增加，p62 被抑制，表明自噬的诱导增强；同时，串联荧光监测显示天麻素预处理增强自噬流量，消除功能失调的线粒体，减少细胞死亡，从而减轻I/R损伤[53]。

4.2.2 中药复方

活血解毒汤具有清热解毒，活血止痛之功效。主瘀血阻滞，日久化热。活血解毒方预处理可降低组织中的自噬：beclin-1 和LC3-II 减少，Bcl-2，p62 和LC3-I / LC3-II 的比率增加，改善组织I/R 损伤[54]。实验证明，补阳还五汤通过SIRT1/自噬途径增加beclin 1 和LC3-II 以及减少p62，促进自噬的重要调节因子sirtuin1 (SIRT1) 的表达，显着增强自噬，减轻I/R 损伤[55]。化浊解毒活血通络方可明显降低缺血再灌注后的自噬水平，下调LC3、Beclin1、Atg5 的表达，上调P62 蛋白的表达，有效改善I/R 损伤[56]。清热化瘀方显著降低I/R 大鼠组织Nix 及beclin-1、LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ表达，抑制线粒体自噬，同时降低ROS、TNF-α 和IL-6 水平，改善大鼠I/R 损伤[57]。桃红四物汤预处理后自噬标记蛋白LC3-II / LC3-I、beclin1、Atg5 和线粒体自噬标记蛋白Parkin（PINK-1）的表达显着升高，活性氧、NLRP3 炎症小体和促炎细胞因子明显减少，从而保护细胞免受I/R 损伤[58]。

5 总结

皮瓣I/R 损伤是一个复杂的生理病理过程，涉及大量的细胞类型、生长因子和细胞因子，且与内质网标志细胞因子GRP78、CHOP 及自噬热点因子LC-3、beclin-1、P62、mTOR 等密切相关，在治疗I/R 中具有巨大的潜力，中药可能通过干预ERS-自噬等位点起效。本文重点讨论了ERS、自噬在皮瓣I/R 损伤中的作用及中药对相关因子的调控趋势，归纳ERS、自噬对皮瓣I/R 损伤的保护作用及相应机制。两种机制相互协同，相互促进，形成一系列的反应来促进皮瓣的成活。但目前缺乏动物实验、细胞水平实验、大样本的临床研究及循证数据支持。中药单体或复方具有高效低毒、多靶点及多通路协调作用的显著优势，在本文文献回顾中，大量中药单体及复方调控相关因子表达，干预ERS、自噬，减轻I/R 损伤，达到提高皮瓣成活率的目的，但其中蕴藏着庞大而错综复杂的调控网络控制着I/R 的发展转归，后期还需通过“网络药理学+细胞生物学实验”等手段对有效成分及作用机制研究，同时进行大样本临床随机对照研究，进而分析中药治疗皮瓣I/R 损伤的优势所在。