胸腹水细胞蜡块制作方法的改良及应用

郑海燕，方庆全，王玉环*

（厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003）

胸腹水脱落细胞学检查因其取材方法简单、方便、快捷、创伤小等优势已成为病理检查的常规方法[1]。传统细胞学涂片常因其细胞量少、细胞退变、结构不清、或细胞与杂质混杂重叠等原因，导致细胞学诊断困难。液基细胞学检查虽然改善了传统细胞学的制片质量，但此检查方法处理的细胞样本不易获得细胞排列方式和背景对照细胞，导致难以鉴别可疑癌和高分化癌细胞、反应性间皮细胞和间皮瘤等[2]，如果将胸腹水标本加以处理制成细胞蜡块，就可以很好地保持组织细胞的完整性，细胞蜡块中细胞排列保留了与实体组织类似的结构，并且细胞蜡块能进行后续特殊染色、免疫细胞化学染色、原位杂交、PCR 等分子生物学检测，将大大提高胸腹水脱落细胞病理学诊断的准确性，为靶向治疗提供可靠的依据[3]。本研究探讨3 种不同固定方法对胸腹水沉淀物制作细胞蜡块效果的影响，以期获得较佳的胸腹水细胞蜡块制作方法，提高诊断的准确率，现报道如下。

材料与方法

1 材料

收集2022 年6 月至12 月厦门大学附属第一医院病理科细胞学涂片确诊见肿瘤细胞的胸腹水标本48 例，其中胸水标本42 例，腹水标本6 例；男21例，女27 例；年龄25 ～84 岁。

2 方法

将送检的新鲜胸腹水标本静置0.5 ～1 h，弃去多余上清液，混匀剩余液体后均分成A 组、B 组、C组，3000 r/min 离心5 min，弃上清。A 组加入5 倍以上体积的4%中性甲醛固定液固定4 h，弃上清后直接取出沉淀物，用包埋纸包裹后放入脱水盒常规脱水、包埋、切片、染色；B 组加液基细胞学检查指定保存液固定4 h，弃上清后直接取出沉淀物，用包埋纸包裹后放入脱水盒常规脱水、包埋、切片、染色；C 组加入5 倍以上体积的4%中性甲醛固定液，混匀，固定5 min，3000 r/min 离心5 min，弃上清，加入75%乙醇，1 min 后吸弃75%乙醇，加入适量的95%乙醇，室温下静置塑形2 h，倒去上清液，用包埋纸包裹后放入10%中性甲醛，进入脱水程序，如果沉淀物较大者，用取材刀沿纵轴每间隔3 mm 平行切开，取其切面作为包埋面（D 组），包埋纸包裹后放入脱水盒常规固定、脱水、包埋、切片、染色。

选取肺腺癌细胞蜡块切片进行HRP Multimer 法免疫组织化学染色，所用一抗包括抗细胞角蛋白7（CK7）、新天冬氨酸蛋白酶 A（napsin A）、甲状腺转录因子1（TTF-1）均购自福州迈新公司。采用瑞士罗氏公司Ventana Benchmark XT 或Ventana Benchmark ULTRA 全自动免疫组织化学仪染色。免疫组织化学切片的阳性信号均呈棕黄色颗粒状。CK7 阳性定位于胞质和胞膜，napsinA 阳性定位于胞质，TTF-1 阳性定位于细胞核。

3 统计学分析

数据分析采用SPSS26.0 统计软件，计数资料用百分率表示，采用χ2检验分析组间差异，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 甲醛液固定后联合95%乙醇塑形细胞蜡块制作成功高

C 组细胞蜡块制作成功率为100%（48/48），显著高于A 组的72.9%（35/48，χ2=15.04,P＜0.01），也显著高于B 组的60.4%（29/48，χ2=23.69,P＜0.01）。

2 甲醛液固定后联合95%乙醇塑形细胞蜡块肉眼观质量优

A、B 组固定后获得的沉淀物较松散，易破碎（图1A、B）；C 组固定后获得的沉淀物聚集成块、富有弹性、结构完整、可见细胞层次（图1C）；沉淀物较大者，沿纵轴每间隔3 mm 平行切开，取其切面作为包埋面，可更大限度的保存标本（图1D）。

图1 不同固定方式制成的细胞蜡块肉眼观。A，4%中性甲醛固定组；B，液基细胞学保存液固定组；C，甲醛固定后乙醇塑形组；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物较大沿纵轴平行切开组Fig. 1 Macroscopic view of cell wax blocks made by different fixation methods. A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, ethanol molding after formaldehyde fixation, large precipitate parallel incision along the longitudinal axis group

3 甲醛液固定后联合95%乙醇塑形细胞蜡块切片HE 染色结果较佳

A 组细胞量偏少，HE 染色较鲜艳，细胞轮廓较清晰，细胞排列较清楚（图2A）；B 组细胞量少，HE 染色偏红，细胞排列方式基本可见，细胞核保存欠佳，部分核有固缩现象（图2B）；C 组细胞量大，HE 染色鲜艳，细胞轮廓清晰，细胞排列清楚可见，肿瘤细胞的核仁比较明显（图2C）；D 组可以最大面积的暴露组织切面，获得更多的目的细胞，细胞量大，HE 染色鲜艳，细胞轮廓清晰，细胞排列清楚可见，肿瘤细胞的核仁比较明显（图2D）。

图2 细胞蜡块切片HE 染色镜下形态。A，4%中性甲醛固定组（箭示核不规则的肿瘤细胞）；B，液基细胞学保存液固定组（箭示印戒样肿瘤细胞）；C，甲醛固定后乙醇塑形组（箭示染色质增粗的肿瘤细胞）；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物较大沿纵轴平行切开组（箭示核大而不规则的肿瘤细胞）；比例尺，100 μmFig. 2 Morphology of cell wax block section under HE staining. A, 4% neutral formaldehyde fixation group (arrow indicating a tumor cell with irregular nucleus); B, liquid-based cytology preservation solution fixation group (arrow indicating a signet ring cell-like tumor cell); C, formaldehyde fixed and ethanol molding group (arrow indicating a tumor cell with coarse chromatin); D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group (arrow indicating a tumor cell with large and irregular nucleus); scale bar, 100 μm

4 甲醛液固定后联合95%乙醇塑形免疫组织化学标记效果较好

A、B、C、D 4 组细胞蜡块切片的CK7 免疫组织化学表达效果均较好，阳性标记清晰易判，背景干净（图3A—D）；A、C、D 3 组细胞蜡块切片的napsin A免疫组织化学表达效果均较好，阳性标记清晰易判，背景干净（图4A、C、D），B 组细胞蜡块切片napsinA 免疫组织化学表达效果欠佳，阳性标记稍减弱（图4B）；A、B、C、D 4 组细胞蜡块的TTF-1 免疫组织化学表达效果均较好，阳性标记清晰易判，背景干净（图5A—D）。

图3 细胞蜡块（胸水肺腺癌细胞）CK7 免疫组织化学检测。A，4%中性甲醛固定组；B，液基细胞学保存液固定组；C，甲醛固定后乙醇塑形组；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物较大沿纵轴平行切开组；箭示阳性表达；比例尺，100 μmFig. 3 Immunohistochemical examination of CK7 in cell wax block (lung adenocarcinoma cells in pleural effusion). A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group; arrows indicate positive expression; scale bar, 100 μm

图5 细胞蜡块（胸水肺腺癌细胞）TTF-1 免疫组织化学检测。A，4%中性甲醛固定组；B，液基细胞学保存液固定组；C，甲醛固定后乙醇塑形组；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物较大沿纵轴平行切开组；箭示阳性表达；比例尺，100 μmFig. 5 Immunohistochemical examination of TTF-1 in cell wax block (lung adenocarcinoma cells in pleural effusion). A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group; arrows indicate positive expression; scale bar, 100 μm

讨 论

目前胸腹水脱落细胞学检查的几种方法各有其优劣势。常规离心涂片法是病理科常规开展的项目，操作简单，出报告快，但与技术员的技术水平密切相关，细胞沉淀取样不当、涂片厚薄不均等均会影响病理诊断结果，如果发现可疑肿瘤细胞，难以进行进一步的检测导致不能完成定性诊断；液基细胞学制片法在样本细胞量比较少时可以得到较高质量涂片，但仪器与耗材成本较高，不适合基层小型医院开展[4]；细胞蜡块技术[5,6]将松散的细胞、组织碎片用石蜡包埋制成蜡块，具有保存细胞新鲜、抗原保留完整、可长期保存、可反复连续切片、能进行特殊染色、免疫组织化学、分子检测等，可提高诊断的准确性。

本实验比较了3 种不同固定方法制作胸腹水细胞蜡块的效果。A 组采用单纯的10%中性缓冲甲醛液作为交联剂，可以与蛋白质相互交联而发生沉淀，从而较好地保持细胞的完整性，穿透性较好，使细胞收缩小，对大多数抗原物质保存较好，但存在细胞不易凝结成块的缺点，所以细胞丢失严重，沉淀物不易成型，易破碎,存在一定的制作失败率，有一定比例的漏诊率。B 组采用液基细胞学检查指定保存液作为固定剂[7]，是一种以乙醇为基础的红色固定剂，其主要成分可以溶解红细胞并沉淀蛋白，并含有脂肪酸，实验过程中发现此方法固定后细胞不易取样包埋，存在较高的制作失败率，而且所得的细胞蜡块HE 染色伊红深染偏红，部分细胞空泡化，部分核有固缩现象，免疫组织化学标记效果欠佳，分析原因是固定液中的脂肪酸被醇类变性，影响蛋白质形成超聚集体，不利于包埋等操作，并且影响后续的染色，因此，B 组方法存在一定的漏诊率与误诊率。C 组采用10%中性甲醛固定后再用乙醇进行塑形，然后制成细胞蜡块，不仅制作细胞蜡块成功率高，而且细胞蜡块切片HE 染色与免疫组织化学检测效果均很好。

作者通过比对95%乙醇塑形0.5 h、1 h、2 h 的效果发现：95%乙醇分别塑形0.5 h、1 h 后，多数沉淀物存在半固态现象，沉淀物无法完全取出，试管壁会有部分沉淀物残留；95%乙醇塑形2 h 后，沉淀物呈固态，可完整取出，试管壁无残留，HE 及免疫组化染色结果良好，获得的细胞数量较塑形0.5 h 与1 h明显增加。因此，采用95%乙醇塑形2h 后制作细胞蜡块的方法较佳[1]，制作成功率高。10%中性缓冲甲醛液作为交联剂，可以与蛋白质交联沉淀，可以较好保持细胞的完整性，穿透性好，细胞收缩小，对大多数抗原物质保存较好。95%乙醇为脂溶性有机溶剂，可帮助细胞沉淀凝固成块，便于塑形，获得的组织块完整，实验得出此联合固定法得到的细胞蜡块HE 染色鲜艳，能清楚地展现完整的细胞形态与结构，免疫组织化学标记清晰容易判读。

血性胸腹水离心后，沉淀物经 10%中性甲醛固定后再用乙醇塑形，可聚集成块。如果沉淀物内含有肿瘤细胞，则沉淀物会分为上下两层，上层为肿瘤细胞层，下层为血浆层，若沉淀物较大时，需用取材刀沿纵轴每间隔3 mm 平行切开，取其切面作为包埋面，这样制作细胞蜡块具有以下优点：①蜡块面横向分为肿瘤细胞层与血浆层，制作切片时，由于包埋面是平面，所以不需要深修蜡块，直接切片即可，不仅方便切片，还可最大程度地保护珍贵的细胞蜡块内的样本；②细胞蜡块内拥有3 mm 厚的组织，不会因过度修片或者多次切片将肿瘤细胞层切光；③由于用切出来的平面作为包埋面，所以容易分辨，包埋此类细胞蜡块时极为方便，不用担心错将血浆层作为包埋面，也就不会因包埋面错误造成漏诊。

综上所述，胸腹水沉淀物先固定后塑形再固定的方法操作简便、成本低、制作成功率高、实用性强、效果好，能有效保护细胞形态、抗原、核酸等，能长期保存标本，有利于后续做进一步的检测，值得推广。