CARD9在真菌感染性疾病中的作用研究进展

杨卓 杨欢

(1.西安市中医医院,西安 710000;2.西安启迪儿童医院,西安 710000)

胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase-associated recruitment domain-containing protein 9,CARD9)是一种信号衔接蛋白,参与多种模式识别受体的信号传导,包括C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLRs)、细胞内Nod样受体(NOD-like receptors,NLR)和核酸传感器,可将Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)和CLRs的信号传递给有丝分裂激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和转录因子核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)[1-2]。由此可见,CARD9在NF-κB和MAPK激活中起关键作用,可导致炎性细胞因子级联的启动,并引发针对微生物入侵的宿主免疫反应,特别是在真菌感染中。

CARD9在人类和小鼠组织中的表达模式几乎相似,在胎盘、小肠、皮肤、肺和脑中均可检测到CARD9基因,在巨噬细胞和树突状细胞中,CARD9的mRNA和蛋白质表达水平最高[3]。CARD9在中枢神经系统、口腔黏膜和皮肤抗真菌免疫反应的激活中具有高度特异性,CARD9基因缺陷患者易患持续性严重真菌感染,表现为易受念珠菌反复感染的特征[4]。此外,CARD9在动物模型中被证明是真菌免疫的重要调节剂,机体CARD9基因的突变或缺乏可引起各种感染及侵袭性疾病,涉及念珠菌、曲霉、新生隐球菌、马拉色菌及皮肤癣菌等[5]。

1 CARD9抗真菌免疫机制

先天免疫系统的细胞构成了人体对抗微生物病原体的第1道防线,它们在组织损伤时调节机体的内环境稳定。CARD9主要在髓系细胞中表达,转导CLRs下游的信号,CLRs作为一个模式识别受体,包括Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3和Mincle,它们对真菌细胞壁的β-葡聚糖、甘露聚糖等具有特异性[6]。这些受体是由Src家族激酶在受体胞质尾部的免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)或相关信号分子的磷酸化激活的。这种激活诱导下游激活级联反应,磷酸化ITAM首先招募和激活脾酪氨酸激酶(SYK),进而磷酸化蛋白激酶C,因而通过CARD9的苏氨酸残基的磷酸化,使CARD9参与活化NF-κB或MAPK途径[7-8]。磷酸化的CARD9招募B-细胞淋巴瘤因子10(recombinant B-Cell CLL,BCL10),BCL10立即与黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1 (mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1,MALT1)旁磷酸酶结合,导致CARD9-BCL10-MALT1(CBM)复合物的形成,这种复合物激活核因子NF-κB和c-Jun N末端激酶,以刺激编码促炎细胞因子和趋化因子的基因转录,如IL-2、IL-10、IL-12等[9-10]。此外,在机体的先天免疫系统中,单核细胞和小胶质细胞中的CARD9信号分别诱导集落刺激因子和趋化因子CXCL1的产生,从而启动中性粒细胞向真菌感染部位的募集,嗜中性粒细胞是真菌吞噬和杀死以及随后清除病原体所必需的[11]。研究发现,CARD9基因缺陷小鼠导致中性粒细胞募集受损,并允许侵袭性真菌生长,CARD9信号还将先天免疫感知与T细胞介导的适应性免疫的激活相结合,并控制Th1和Th17细胞的分化[12]。T细胞介导的细胞免疫是机体抗真菌的主要免疫效应,Th1和Th17细胞发挥抵御真菌侵袭的作用,Th1细胞效应因子γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)可增强巨噬细胞对真菌的吞噬杀伤作用,Th17细胞效应因子IL-17调节中性粒细胞募集,增加抗微生物多肽分泌,从而增强宿主免疫防御[13]。而在CARD9基因缺陷患者体外表现为巨噬细胞、树突状细胞和外周血单核细胞分泌细胞因子和趋化因子的功能受损,中性粒细胞对某些真菌的杀灭也存在缺陷,CARD9缺陷患者外周血中Th1/Th17细胞比例降低,效应因子分泌缺乏,因而更容易感染真菌[14]。研究发现,CARD9基因缺陷小鼠IL-17的产生显著减少,Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的产生显著增加,这表明CARD9介导的信号传导是M1巨噬细胞活化和诱导所必需的,其中CARD9对诱导细胞因子的产生至关重要[15]。CBM复合物能激活IKK复合体,最终介导包含p65-p50或REL-p50的NF-κB进入细胞核,促进促炎症因子的产生,发挥抗真菌感染作用[16]。因此,CARD9介导的免疫是抗真菌病原体保护性免疫的重要调节剂,也是连接先天免疫和获得性免疫之间的重要联系,对于人体抵御各种真菌的系统宿主防御是必不可少的,这在微生物感染,特别是侵袭性真菌感染中得到了很好的证实[17]。

2 CARD9与真菌感染

2.1 CARD9与侵袭性真菌感染

侵袭性真菌感染(invasive fungal diseases,IFD)主要与念珠菌、曲霉以及新生隐球菌相关,占真菌感染的90%左右,是免疫功能低下人群的易感疾病,CARD9缺陷是IFD发病的主要遗传学病因,IFD可能是由先天免疫缺失引起的,例如IL17和CARD9免疫的先天性缺失[18]。机体CARD9缺乏导致对真菌特异性和中枢神经系统靶向感染的敏感性,正常情况下CARD9可促进中性粒细胞向真菌感染的中枢神经系统募集,介导真菌清除。CARD9在Th1和Th17反应的分化中起着关键作用,通过激活典型的NF-κB信号来诱导巨噬细胞和树突细胞中IL-6、IL-1β和IL-12的产生[19]。迄今为止,已发现多种CARD9基因改变而引起的多种真菌感染,包括念珠菌感染、曲霉感染、新生隐球菌感染等。

念珠菌感染 念珠菌(Candida)是一类最常见的人类机会性致病真菌,侵袭性念珠菌病可致命,白念珠菌是其中最为常见且致病性也最强的致病菌,占念珠菌(Candidaalbicans)感染的75%[20]。常染色体隐性CARD9缺乏易感染深部真菌病及侵袭性念珠菌病,CARD9的先天性变异影响其与在脑中表达的Ras-GRF1蛋白结合造成真菌易感,CARD9基因相关侵袭性念珠菌病患者,常累及中枢神经系统,引起念珠菌性脑膜脑炎[21]。据统计,目前共发现CARD9突变体22种,常见的突变体有6种,我国1例以中枢神经系统感染主要临床表现的侵袭性念珠菌病患儿进行全基因外显子组检测及一代测序验证,发现了CARD9基因存在c.952-12956delinsAG纯合变异,为未报道的致病变异,丰富了CARD9基因的变异多样性[22]。最近研究证明,骨髓来源的抑制性细胞(myeloidderived suppressor cells,MDSCs)在抗念珠菌感染中具有显著抑制免疫细胞应答的功能,致病性念珠菌可通Dectin-1及CARD9诱导中粒样髓源抑制细胞(G-MDSC)生成,其中白念珠菌是G-MDSC最强的诱导剂[13]。

此外,在侵袭性念珠菌病患者中,CARD9的突变与保护性抗真菌IgG反应受损有关,这种抗真菌IgG能特异性识别白念珠菌,IgG的产生依赖于固有免疫调节因子CX3CR1+单核巨噬细胞(MNPs),编码CX3CR1的基因中的SNPs位点与CD患者的抗真菌IgG反应密切相关,CX3CR1+MNPs在肠道抗真菌免疫中起关键作用,80%以上的CX3CR1+MNPs能有效识别和应答念珠菌[23]。CARD9蛋白在中性粒细胞杀伤白念珠菌孢子免疫过程中发挥着关键作用,CARD9缺陷可严重影响白念珠菌刺激后具有可趋化免疫细胞至感染部位发挥抗感染作用的中性粒细胞IL-8的表达,导致中性粒细胞杀伤白念珠菌功能的异常[24]。Alves等[25]在对真菌感染的患者进行基因检测中发现,外周血Th17、IL-6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等在白念珠菌刺激下分泌减少,这与CARD9基因突变导致的外周血中性粒细胞吞噬能力缺陷有关[26]。对白念珠菌性脑膜脑炎患者进行G-CSF辅助治疗后,患者的症状及影像学均恢复正常。Drummond等[27]发现小胶质细胞特异性CARD9缺失损害了IL-1β和CXCL1的产生和中性粒细胞的募集,并增加了中枢神经系统中真菌的增殖。念珠菌毒素通过与小胶质细胞结合,产生IL-1β和CXCL1,作用于保护性募集趋化因子表达受体的中性粒细胞。重要的是,小胶质细胞IL-1β和CXCL1的产生依赖于CARD9,小胶质细胞CARD9的特异性缺失会损害中性粒细胞对白念珠菌感染的中枢神经系统的募集。由此可见,人体之所以易受IFD,可能主要是由于的CARD9基因缺陷导致机体免疫系统减弱,中枢神经系统对真菌的易感性增强。

曲霉感染 曲霉为低毒力条件致病菌,主要存在人体呼吸道、鼻窦、外耳道中,一般不感染正常人,免疫功能低下或粒细胞减少时,曲霉可经破损皮肤黏膜或呼吸道进入人体引起感染。CARD9单核苷酸多态性S12N最近显示在过敏性支气管肺曲霉病患者中高度富集,CARD9变体激活RelB,随后通过肺泡巨噬细胞激活IL-5的产生,并在肺中驱动致病性嗜酸性粒细胞募集和Th2反应[28]。Xu等[29]发现CARD9S12N在接触CLR后促进了2型免疫反应的诱导,从而证明CARD9S12N可以将肺泡巨噬细胞转化为产生IL-5的细胞,并促进Th2细胞介导的病理反应,CARD9S12N介导CLR诱导的非典型转录因子NF-κB亚单位RelB的激活,启动肺泡巨噬细胞中细胞因子IL-5的产生,以募集嗜酸性粒细胞来驱动Th2细胞介导的过敏反应。表达CARD9S12N的先天单核细胞是Th2细胞介导的过敏反应协调过程中产生IL-5的主要来源。CARD9通常与RelB相关联以抑制其激活,而S12N取代削弱了CARD9与RelB的关联,从而导致Dectin-1介导的RelB激活以调节IL-5表达。CARD9S12N将先天单核细胞转化为产生IL-5的细胞的能力,为探讨先天免疫系统和过敏性疾病之间的联系建立了新的范式。

新生隐球菌感染 新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)是继白念珠菌之后最常见的条件致病真菌,常在鸽子等鸟类的粪便沉淀物中繁殖。这种真菌通过空气传播途径感染宿主,可在免疫功能严重受损的个体中引起肺部和中枢神经系统感染。Dectin-2或CARD9基因敲除小鼠对在树突状细胞吞噬新生隐球菌中的作用明显降低,认为Dectin-2可能通过CARD9介导的信号通路在树突状细胞对新生隐球菌的肌动蛋白聚合和吞噬过程中发挥重要作用[30]。此外,CARD9及上游受体Mincle在宿主防御新生隐球菌感染中起着关键作用,在隐球菌感染早期,野生型小鼠肺中Mincle的表达以CARD9依赖的方式增加,而CARD9基因敲除小鼠的Mincle表达显著低于野生型小鼠[31]。Yamamoto等[32]研究发现,CARD9基因敲除小鼠对新生隐球菌的经呼吸道感染高度敏感,在感染的先天免疫阶段,干扰素α是宿主抵御新生隐球菌感染的关键细胞因子,CARD9缺陷导致产生干扰素的记忆表型T细胞在肺内蓄积受损,增加对新生隐球菌肺部感染的易感性,导致肺部真菌清除率降低。Th1细胞分化是宿主抵御新生隐球菌感染的关键过程,CARD9基因敲除小鼠Th1相关细胞因子的合成缺陷会加剧新生隐球菌感染。

2.2 CARD9与马拉色菌感染

马拉色菌(Malassezia)隶属担子菌门(Basidiomycota),广泛存在于人体皮肤表面和胃肠道中,有潜在致病的可能。研究发现,CARD9多态性有利于马拉色菌定植,CARD9的缺失不仅可能导致对真菌病原体的易感性,还可能增加炎症性肠病(inflammation bowel disease,IBD)的发病风险[33-34]。Lamas等[35]发现,CARD9是IBD的易感基因,CARD9主要通过CLRs参与对马拉色菌的免疫应答,激活IL-22或介导核苷酸结合寡聚化结构域介导MAPK信号和调节TLRs信号等途径来促进溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的康复。CARD9也与肠道真菌失调密切相关,在CLRs介导的全身性真菌感染中,CARD9可将先天免疫与Th17细胞分化联系起来,起关键的信号传导作用,CARD9缺陷的小鼠肠道菌群会发生改变,表现出生物失调,小鼠更容易患UC[36]。CARD9单核苷酸多态性是CD的遗传危险因素之一,在CARD9S12N多态性的克罗恩病(Crohn's disease,CD)患者中,限制马拉色菌(M.restricta)能够恶化其肠道炎症,提示CARD9相关信号通路对于机体感知限制马拉色菌起重要作用[37]。另外,在大部分的肠道肿瘤疾病中显示出CARD9基因的异常,CARD9还可通过改变肠道菌群控制MDSC分化来调节肠道抗肿瘤免疫,缺乏CARD9的巨噬细胞显示出杀真菌能力受损,这导致肠道中真菌增加,诱导了MDSC积累[38]。也有研究表明CARD9下游的NF-κB信号通路是目前认为调控IBD炎症反应的重要信号通路之一,参与炎性因子的转录[39]。由此可见,CARD9可通过参与真菌免疫反应减少IBD的发生,同时也可通过调控肠道菌群对肠道肿瘤性疾病进行免疫。

2.3 CARD9与皮肤癣菌感染

皮肤癣菌病是一种全球范围内常见的疾病,红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)为主要致病菌,CARD9基因突变引起的皮肤癣菌感染不仅累及浅表皮肤、甲、头皮等,还可累及淋巴结、中枢神经系统等部位发生深部皮肤癣菌病或引起全身泛发的皮肤癣菌病。先天免疫和适应性免疫在皮肤抗真菌防御中起重要作用,CLRs参与皮肤真菌的识别,这种识别诱导细胞内信号级联,其中CARD9衔接蛋白起核心作用,在宿主抵御真菌病原体的防御中发挥重要作用,并诱导产生促炎细胞因子,负责将免疫细胞募集到感染部位[40]。陈佳沁等[41]研究发现,CARD9基因敲除影响HaCaT细胞IL-6和IL-8的分泌,认为CARD9基因的突变和缺失会损害机体对真菌的抗感染免疫,CARD9基因还可能介导了红色毛癣菌感染诱导的IL-6、IL-8下调,这表明CARD9在皮肤癣菌病致病机制中存在十分重要的作用。Majocchi肉芽肿作为皮肤癣菌深部感染的一种,有研究表明,CARD9缺陷使得宿主天然免疫受损,使皮肤癣菌出现深部感染,因此认为CARD9缺陷与Majocchi肉芽肿的发病机制有密切联系[42]。Lanternier等[43]将来自5个国家共25名患者进行研究,发现所有深部皮肤真菌病患者均有常染色体隐性遗传性CARD9缺陷。由此可见,CARD9与皮肤癣菌病所致的各类皮肤真菌感染类疾病都有密切的联系,在衔接先天免疫和适应性免疫中发挥重要作用。

3 小结与展望

综上所述,CARD9在真菌感染类疾病中的作用与介导机体先天免疫有关。无论是发生于皮肤、组织还是脏腑的真菌感染类疾病,缺乏CARD9及其变体的机体都表现出对真菌的易感性,由此可见CARD9在机体的先天免疫中扮演着不可缺少的角色。今后的研究或可深入到其他真菌感染类疾病与CARD9是否也有密切联系,是否与其他通路有密切联系,哪些受体参与了皮肤真菌的免疫,以便更好地明确CARD9在真菌感染类疾病中的作用,为临床治疗靶点选择提供新的思路。