Box-Behnken响应面设计法优化商陆鲜制饮片工艺

王海燕，陈 重，余春生，杨俊杰

（1.信阳农林学院制药工程学院，河南 信阳 464000；2.武汉禾元生物科技股份有限公司，武汉 430074）

商陆为商陆科植物商陆（Phytolacca acinosaRoxb.）或垂序商陆（Phytolacca amerrcanaL.）的干燥根［1］，始载于《神农本草经》，是一种应用历史悠久的中草药，有逐水消肿、通利二便、解毒散结的功能。商陆药材在兽用方面有广泛的用途，特别是用于家禽类泌尿系统感染方面［2］。现代药理研究表明，不同商陆提取物均能降低血清UA、Cr、肾组织NO 水平及肾指数，对鸡肾肿症有较好的治疗效果［3］。商陆总皂苷对癌性腹水模型小鼠具祛腹水作用［4］，商陆皂苷甲对哮喘小鼠气道炎症有缓解作用［5］，抑制Aβ诱导的原代小胶质细胞炎症反应［6］，为商陆的有效成分，也是商陆质量评价的指标性成分。

商陆为多年生草本，根茎肥大，干燥后切片困难，故在产地采收过程中，通常把商陆切成厚片或段，便于干燥，再加工成不同规格饮片，干燥方法［7］和不同饮片［8］所含化学成分及药理效应有显著差异。商陆药材在加工成饮片的过程中，由于产地加工片过厚，不利于调剂，需要重新润湿，薄切，干燥。产地加工环节和炮制环节的重复操作，会造成有效成分的损失；另外商陆药材贮藏运输过程中，极易霉变，影响药材质量和用药安全。将中药材产地加工与中药炮制一体化（“一体化”工艺），从鲜药材直接加工成饮片，以减少中间重复环节，可以保证中药饮片质量。杨俊杰等［9，10］对商陆产地加工和炮制的现代研究进展进行系统梳理，但有关商陆鲜制饮片的具体操作工艺及系统加工参数未见报道，趁鲜切制工艺方面的研究尚属空白。

本试验采用商陆总皂苷和商陆皂苷甲含量的综合评分为评价指标，运用Box-Behnken 响应面设计法，考察商陆鲜品切制厚度、干燥温度、干燥时间3个因素的交互影响，确定商陆的鲜制饮片加工工艺，以期为商陆饮片的工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Agilent1100 型高效液相色谱仪（VWD 紫外检测器，Agilent 化学工作站），购自美国安捷伦科技有限公司；UV1901 型紫外-可见分光光度计，购自北京普析通用有限公司；电子分析天平，购自瑞士梅特勒公司。

1.2 主要药品与试剂

商陆于2021 年11 月在信阳市平桥区丘陵坡地采挖，经信阳农林学院周巍副教授鉴定为商陆科植物垂序商陆的新鲜根茎；商陆皂苷甲对照品（HPLC≥98%，批号为ZY151023），购自上海谱振生物科技有限公司；葡萄糖对照品（批号为GBW10062），购自中国计量科学院；乙腈为色谱纯；试验用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

1.3 商陆总皂苷的测定

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取商陆皂苷甲对照品适量，用甲醇配制成浓度为1.98 mg/mL 的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备 取商陆粗粉约4 g，精密称定，加95%乙醇80 mL，用索氏提取器连续回流6 h。减压浓缩至10 mL，取出，加入5 g 硅藻土拌匀，于水浴锅上挥干。将残渣置于100 mL 锥形瓶中，加50 mL 用水饱和的正丁醇，超声提取40 min，过滤，将滤液减压浓缩至干，用少量甲醇溶解残渣，10 mL 容量瓶定容，过滤，取续滤液1 mL，用甲醇定容至10 mL，即得。

1.3.3 线性范围考察 精密移取商陆皂苷甲对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加甲醇补足至1.0 mL，加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，77%硫酸8.5 mL，60 ℃水浴恒温保持10 min，再置冰水浴中15 min。用紫外-可见分光光度计于450 nm 处测定吸光度（A），以吸光度对浓度进行线性回归，得到回归方程A=3.354 2C+0.130 6（r=0.999 5）。结果表明，商陆皂苷甲在0.019 8～0.198 0 mg/mL 浓度范围与吸光度线性关系良好。

1.3.4 精密度试验 精密移取对照品溶液1.0 mL，按“1.3.3”方法显色、测定吸光度6 次，结果RSD为1.32%，表明仪器精密度良好。

1.3.5 稳定性试验 精密移取供试品溶液1.0 mL，按“1.3.3”方法显色，显色后每隔5 min 测定1 次，共7次。结果RSD为1.61%，表明该供试品溶液显色后30 min 内稳定。

1.3.6 重复性试验 取同一批次商陆样品6 份，按“1.3.2”供试品溶液制备方法和“1.3.3”显色方法，分别测定计算总皂苷含量，结果RSD为1.37%，表明该方法重复性良好。

1.3.7 加样回收率试验 取商陆样品（总皂苷质量分数1.762%）约2.0 g，共6 份，精密称定，分别加入商陆皂苷甲对照品约10 mg，测定样品中总皂苷含量，由表1 可知，平均回收率为99.85%，RSD为1.46%，表明该方法准确可靠。

表1 商陆总皂苷加样回收试验结果

1.4 商陆皂苷甲的含量测定

1.4.1 色谱条件 PM 952505-C18 色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），以含甲酸（0.1%）的乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，按照表2 所示方法进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，柱温30 ℃，进样量为20 μL，理论塔板数按商陆皂苷甲计不低于3 000。

表2 商陆皂苷甲含量测定梯度洗脱条件

1.4.2 对照品溶液的制备 精密称取商陆皂苷甲对照品5.2 mg，用甲醇定容至10 mL 容量瓶，制得浓度为0.52 mg/mL 的商陆皂苷甲对照品溶液。

1.4.3 供试品溶液的制备 取商陆粗粉约2 g，精密称定，置50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，称重，超声处理（500 W，40 kHz）40 min，放冷，用50%甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液得。

1.4.4 线性关系考察 精密吸取“1.4.2”对照品溶液，分别进样3、6、9、12、15 μL 注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，以峰面积的积分值（A）为纵坐标、对照品进样量（m）为横坐标，进行线性回归，得到回归方程A=1.430 2m+9.311 8（r=0.999 8），表明商陆皂苷甲在1.56～7.80 μg 线性关系良好。

1.4.5 精密度试验 精密吸取0.52 mg/mL 商陆皂苷甲对照品溶液进样20 μL，重复进样5 次，以峰面积计算RSD，RSD为1.70%，表明该仪器精密度良好。

1.4.6 稳定性试验 取商陆样品粗粉约2 g，精密称定，按“1.4.3”方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h 测 定 商 陆 皂 苷 甲 含 量，结 果RSD为0.36%，表明该方法在24 h 内稳定性良好。

1.4.7 重复性试验 取商陆样品粗粉2 g，按“1.4.3”方法制备供试品溶液，平行试验6 份，结果样品中商陆皂苷甲含量的RSD为1.42%，表明该方法重复性良好。

1.4.8 加样回收试验 精密称取已知含量（0.473%）的商陆粗粉共6 份，每份约0.5 g，分别加入商陆皂苷甲对照品约2 mg，按“1.4.3”方法制备供试品溶液，测定商陆皂苷甲含量，计算加样回收率，结果见表3，平均回收率为100.74%，RSD为1.31%，表明该方法准确可靠。

表3 商陆皂苷甲加样回收试验结果

1.5 综合评分方法

《中华人民共和国药典》（2020 年版）规定商陆的指标性成分为商陆皂苷甲，以干燥品计算，不得少于0.15%。商陆的有效成分主要为商陆总皂苷，加工过程中会伴有商陆皂苷的转化，影响到商陆皂苷甲的含量。故将商陆皂苷甲和商陆总皂苷作为评价指标，综合考虑。指标评分具体公式如下。

式中，X为总皂苷含量（%），Xmax为正交试验设计9 组试验中总皂苷含量的最大值，Y为商陆皂苷甲含量（%），Ymax为商陆皂苷甲含量的最大值。

1.6 单因素考察

1.6.1 切片厚度考察 商陆在产地加工过程中，为方便干燥保存，一般切成5 cm 左右的厚片，待饮片厂收购后再重新润透、薄切，以利于调剂使用。本试验选择的切片厚度分别为1、3、5 mm。取新鲜商陆用多功能切药机按照上述厚度切片，分别取3 份样品，于55 ℃干燥，粉碎后进行测定。

1.6.2 干燥时间选择 切片越厚，干燥需时越长。因此选择5 mm 片作为考察干燥时间的样品厚度，在不同温度下35、45、55、65、75 ℃干燥，分别于不同时间点2、4、8、12、16 h 取样、粉碎，测定含量。

1.6.3 干燥温度选择 取新鲜商陆，切3 mm 厚片，分别取3 份于35、45、55、65、75 ℃下干燥。取饮片粉碎，过二号筛，测定各指标含量。

1.7 Box-Behnken 响应面设计

选择切片厚度（A）、干燥温度（B）、干燥时间（C）3 个因素作为自变量，以商陆总皂苷、商陆皂苷甲含量2 个指标的综合评分为效应值，根据Box-Behnken响应面设计原理，运用3 因素3 水平的响应面设计法进行分析。在单因素试验结果的基础上，确定Box-Behnken 响应面设计因素水平见表4。

表4 试验因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素考察结果

2.1.1 切片厚度考察结果 切片厚度考察结果如表5所示。结果表明，当商陆饮片厚度增大时，商陆总皂苷、商陆皂苷甲含量明显增加，在3 mm 时各指标性成分含量较高，且片形较好，不易造成碎片，因此选择3 mm 作为考察水平。

表5 切片厚度对商陆有效成分含量的影响

2.1.2 干燥温度考察结果 干燥温度考察结果如表6所示。在55 ℃时，商陆饮片指标性成分的含量都较高，且干燥时间较短，适于大量生产，因此，商陆饮片于55 ℃下干燥较为合适。

表6 干燥温度对商陆有效成分含量的影响

2.1.3 干燥时间考察结果 不同干燥温度、干燥时间条件下，商陆水分含量、总皂苷含量、皂苷甲含量见表7。对商陆烘干过程考察发现，高温条件75 ℃下干燥8 h，药材含水量小于13.0%，符合《中华人民共和国药典》规定，低温条件35 ℃干燥16 h，同样能达到要求。同时发现，干燥时间延长会造成商陆有效部位和有效成分的损失。综合考虑本试验设定干燥时间为12 h。

表7 干燥时间对商陆水分及有效成分含量的影响

2.2 Box-Behnken 响应面设计

将试验结果输入Design Expert 8.06 软件，得试验结果如表8 所示。

表8 响应面试验设计方案及结果

2.3 回归模型的建立与分析

用Design Expert 8.06 软件对表8 结果进行二次多元回归拟合，得到回归模型为R1=95.19-0.80A+2.47B+1.13C-0.63AB+1.42BC-1.07A2-5.72B2-6.45C2。

对回归模型进行方差分析，结果如表9 所示。由表9 可知，该模型P＜0.01，表明本回归模型差异极显著，试验设计可行，误差较小。失拟项P＞0.05，差异不显著。经可信度分析，校正决定系数为0.884 8，信噪比为10.648 0，远大于4。表明使用该方程拟合效果较好，其他因素对试验结果干扰较小，因此，可以用该方程确定商陆鲜制切片的最佳工艺参数。由试验结果可知，干燥温度（B）及其二次方的P均较小，表明其对商陆切制工艺的影响较显著。3 因素对综合评分的影响为干燥温度＞干燥时间＞切片厚度。三者的交互等高线以及响应面曲线见图1。响应曲面越陡峭，说明该因素对综合评分的影响越显著；响应曲面平缓，则说明该因素对综合评分的影响不显著。结合表9 和图1 可知，切片厚度与干燥时间的交互作用对综合评分的影响极显著；切片厚度与干燥温度、干燥温度与干燥时间的交互作用对综合评分的影响不显著。

表9 响应面试验设计结果方差分析

2.4 响应面优化及验证

由Design Expert 8.06 软件得到商陆切片的最佳提取条件为厚度2.58 mm、干燥温度54.11 ℃、干燥时间9.57 h。在此条件下，综合得分为96.00%。考虑到实际操作，将最佳工艺条件修正为厚度3 mm，干燥温度55 ℃，干燥时间10 h。按照所得参数条件，加工3 批商陆饮片，分别测定商陆总皂苷和商陆皂苷甲含量后，计算得到综合评分为95.21%±0.63%，与预测值十分接近，表明本试验确定的优化工艺结果可靠，具有一定的实用价值。

3 小结与讨论

《中华人民共和国药典》收录的商陆质量标准中，规定测定的指标性成分为商陆皂苷甲，既是其有效成分，又是其毒性成分，但商陆的生物活性是多种皂苷综合作用的结果，同时，加工炮制过程中，存在不同皂苷的结构转化，故在本试验设计中，对商陆皂苷甲和总皂苷的含量作综合分析，使试验设计更加科学。工艺研究过程中，Box-Behnken 响应面法既可以减少单因素交叉试验的繁琐，又较传统的正交试验减少人为因素对结果的影响，特别是能反映出各因素之间的交互作用变化，使试验结果更加合理。由于样品采集的局限性，试验所用批量较小，需进一步中试和扩大生产验证。商陆属于多年生药材，生长年限和采收时节是否会对成品饮片的质量造成影响，尚待进一步研究。

本试验研究表明，商陆鲜制饮片加工过程中，影响因素为干燥温度＞干燥时间＞切片厚度，其中干燥温度影响显著，切片厚度和干燥时间交互影响极显著。优化工艺为厚度3 mm，干燥温度55 ℃，干燥时间10 h。本试验从技术层面验证了商陆产地加工与炮制一体化工艺的可行性，可为今后的商陆饮片生产提供参考。