高效液相色谱法同时测定不同品种菊花中绿原酸和木犀草苷及异绿原酸A 含量

周瑞娜，杨莹莹，李国鹏，周 伟，程 敏

（1.陕西中医药大学药学院，陕西咸阳 712046；2.广西中医药大学药学院，南宁 530000；3.商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000；4.陕西康城药业股份有限公司，陕西商洛 726000；5.陕西香菊药业集团有限公司，陕西商洛 726000）

中药材菊花为菊科植物菊（Chrysanthemum morifoliumRamat.）的干燥头状花序，菊广泛分布于中国东北、华北、华中以及西南地区。菊花味甘、苦，性微寒，归肺、肝经，具有散风清热、平肝明目、清热解毒的功效，是常用清热泻火的良药［1］。《中华人民共和国国药典（2020 年版）》根据产地和加工方法不同，将其分为亳菊、滁菊、贡菊、杭菊和怀菊。菊花中化学成分含量复杂，黄酮类、挥发油、苯丙素类、萜类、氨基酸等是其主要成分，其中黄酮和苯丙素类化合物为菊花的主要药效成分［2］。现代医学研究证明，菊花的药理作用广泛，具有抗动脉硬化、抗缺氧、降血脂、抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用［3-10］。此外，在心脑血管、免疫调节及促进胆固醇代谢等方面，如高血压、高血脂等疾病，临床上应用广泛［11，12］。《中华人民共和国国药典（2020 年版）》将木犀草苷、绿原酸和异绿原酸A 这3 种成分作为菊花含量测定内容。陕西香菊药业有限公司大力发展菊花药源基地品牌建设，大规模栽植兼具药用和观赏价值的杭白菊、怀菊（黄叶、白叶）、亳菊和金丝皇菊，年产值达百万元。由于菊花品种繁多，所含化学成分有一定差异，品质上参差不齐［13］，因此，本试验采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定［14］杭白菊、怀菊（黄叶、白叶）、亳菊和金丝皇菊［15］4 个不同品种菊花中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的含量，以期为不同品种菊花质量控制方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杭白菊、黄叶怀菊、白叶怀菊、亳菊、金丝皇菊样品均采自陕西香菊药业有限公司药源基地，经中国中医科学院商洛中药材GAP 科研工程中心李筱玲鉴定为菊科植物菊。药材经清洗、烘干、粉碎，过1号筛［内孔径（2 000±70）μm］待用。绿原酸对照品（批号110753-202119，含量98.70%）、木犀草苷对照品（批号111720-202111，含量98.65%）、异绿原酸A对照品（批号111782-202208，含量98.85%），中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯；磷酸为分析纯；水为去离子水。

1.2 试验设备

LC-2030C 3D Plus 型高效液相色谱仪、ATX224型电子天平（SHIMADZU 公司）；KQ5200DB 型数控超声波清洗器（上海楚定分析仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Alphasil VC-C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱0～11 min，10%～18%A，90%～82%B，11～30 min，18%～29%A，82%～80%B，30～40 min，20%A，80%B；流 速 为1.0 mL/min，检 测 波 长 为348 nm，柱温为30 ℃，进样量为5 μL。

1.3.2 溶液制备

1）对照品溶液。精密吸取浓度为40.311 μg/mL的绿原酸溶液5 mL、浓度为23.167 μg/mL 木犀草苷溶液3 mL 和浓度为101.994 μg/mL 异绿原酸A 溶液10 mL，将其移入棕色容量瓶内，再加入70%的甲醇得到绿原酸、木犀草苷和异绿原酸A 的混合对照品溶液，储存在低于10 ℃的温度下。

2）供试品溶液。分别精密称取不同品种菊花样品（过筛）约0.25 g，放入容量瓶中，加入25 mL 70%的甲醇，塞紧瓶塞，称重，在300 W、45 kHz 下超声处理40 min，待冷却后，再次称重，继续将70%的甲醇加入到容量瓶中，补足失去的重量。将容量瓶充分摇匀后过滤，得到的滤液即是供试品溶液。

3）阴性样品溶液。按“1.3.2”中供试品溶液的制备方法，分别制成缺绿原酸、缺木犀草苷、缺异绿原酸A 的阴性样品溶液。

1.3.3 方法学考察

1）专属性考察。精密量取适量绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 混合对照品溶液和供试品溶液，按“1.3.1”的色谱条件下进样，分析该方法的专属性。

2）线性关系考察。将10、20、40、80、100、120 mL的绿原酸对照品，5、10、30、40、60 mL 的木犀草苷对照品，20、40、120、160、240 mL 的异绿原酸A 对照品溶液精密量取，分别转移至25 mL 棕色容量瓶中，在盛有对照品的容量瓶内加入70%甲醇溶液，稀释至25 mL，使之形成系列不同浓度梯度的溶液。按照“1.3.1”中的色谱条件进样5 μL 样品溶液，对结果进行回归分析。

3）精密度试验。分别精密吸取绿原酸、木犀草苷和异绿原酸A 的混合对照品10 μL，按照“1.3.1”中的色谱条件重复进样5 次（n=5），同时记录各成分的峰面积，考察试验的精密度。

4）稳定性试验。精密吸取7 份按照“1.3.2”所述方法制备的相同批次不同品种菊花样品，分别于0、2、4、8、12、20、24 h 后加样进行测定，并记录峰面积。

5）重复性试验。按“1.3.2”中的方法取同一批不同品种菊花粉末样品，制备4 份供试品溶液，重复进样测定，计算各组分的含量，测试重复性。

6）加样回收试验。取6 份已知含量的药材样品粉末（过筛），每份约0.25 g，精密称量后，再将按照“1.3.2”的方法配制好混合的对照品溶液加入到样品溶液中，按照“1.3.2”的方法制备供试品溶液，取10 μL，将样品进样，并记录峰面积。

1.3.4 样品含量测定 称取菊花样品粉末（过筛）约0.25 g，按照“1.3.2”中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，不同品种菊花平行制备3 份供试品溶液，每份样品进样5 μL，测定菊花中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

2.1.1 专属性考察 由图1 可知，混合对照品溶液中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的保留时间分别为9.407、19.637、24.699 min。样品中3 个成分的保留时间与对照品一致，且都能够完全被分离，阴性样品溶液未受到干扰，供试品溶液的杂质对绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的色谱峰也未构成干扰。试验结果表明，该方法具有良好的专属性。

2.1.2 线性关系考察 以绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的质量浓度（x）为横坐标，峰值积分值（y）为纵坐标。得到绿原酸的线性回归方程y=14 927.7x-54 252.0（R2=0.999 8）。木犀草苷的线性回归方程为y=46 822.1x+51 597.2（R2=0.999 3）。异绿原酸A的为y=21 455.1x-96 399.3（R2=0.997 4）。结果显示，绿原酸在9.674～120.930 μg/mL、木犀草苷在4.344～57.918 μg/mL、异绿原酸A 在19.124～254.985 μg/mL水平上均表现出良好的线性关系。得到的回归方程见表1。

2.1.3 精密度试验 结果显示，绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 峰面积的RSD分别为0.087%、0.322%和0.340%，表明该仪器性能稳定。

2.1.4 稳定性试验 结果显示，绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的峰面积RSD分别为0.352%、0.794%和1.124%。表明供试品溶液在24 h 内具有良好的稳定性。

2.1.5 重复性试验 结果显示，4 个样品（n=4）中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的含量平均值分别为1.995%、15.596%和41.965%，RSD分别为0.211%、0.750%和0.794%。表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收试验 绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的平均回收率分别为97.65%、96.40%和98.07%，RSD分别为1.27%、0.69%和1.81%。表明该方法准确性良好，结果见表2。

表2 菊花中3 个活性成分的加样回收率（n=6）

2.2 菊花样品3 个活性成分含量测定

通过对4 个不同品种菊花中3 个成分进行定量分析，结果（表3）显示，绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A 的质量分数分别为0.357 5%～0.787 2%、0.187 9%～0.823 9%、0.761 1%～1.616 9%，均高于《中华人民共和国药典（2020 年版）》规定的菊花含量测定标准，且3 个组分在不同品种中的含量有较大差异。其中，绿原酸含量最高的是亳菊（0.787 2%），其次是怀菊、杭白菊、金丝皇菊；木犀草苷含量最高的为金丝皇菊（0.823 9%），其次是杭白菊、怀菊、亳菊；异绿原酸A 含量最高的是亳菊（1.616 9%），其次是怀菊、杭白菊、金丝皇菊。另外，亳菊中绿原酸、异绿原酸A 2 种成分含量均高于其他3 个品种，而金丝皇菊中这2 种成分含量则较低。以上结果可能与不同品种菊花中所含活性物质含量本身存在差异有关，也可能与其种植、加工炮制工艺有关。

表3 不同菊花样品3 个活性成分含量的测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

前期预备试验结果表明，通过使用二极管阵列检测器来检测3 种成分在200～600 nm 波长范围内的吸收峰，绿原酸、木犀草苷以及异绿原酸A 分别在327、350、348 nm 处有最大吸收值。检测不同波长的峰面积、杂质峰的干扰和基线的平滑度，最终将检测波长设定为348 nm。

3.2 流动相的选择

前期预备试验比较了不同A、B 相甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-水以及乙腈甲酸等的分离效果。甲醇-水和乙腈-甲酸在洗脱过程中由于杂质的强烈干扰而显示出较差的分离效果。使用甲醇-0.1%磷酸溶液时，色谱峰很弱，理论塔板数也很低。当使用乙腈溶液和0.1%的磷酸溶液时，色谱峰与相邻的色谱峰完全分离，杂质没有干扰到被测组分的色谱峰。因此，本试验选择0.1%磷酸溶液和乙腈作为试验条件。此外，色谱图显示，部分色谱峰的保留时间不同，这可能与色谱柱的效率有关。

3.3 提取溶剂的选择

预备试验研究了提取溶剂甲醇、乙醇和70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇对待测成分含量的影响。结果发现，采用70%甲醇提取菊花样品时，绿原酸、木犀草苷和异绿原酸A 3 个参数最高，因此，试验确定70%甲醇作为提取溶剂。

4 小结

试验采用高效液相色谱法同时测定不同菊花品种中绿原酸、木犀草苷以及异绿原酸A 3 种指标性成分的含量，并对其进行了分析验证。试验数据表明，本试验所采用的方法具有准确、简便、重现性好的特性，并且回收率与现行标准相符，可以作为菊花的定量控制方法，同时该方法也为建立不同品种菊花质量评价、检验标准提供了科学依据。