星点设计-效应面法对左氧氟沙星泊洛沙姆407/188眼用凝胶的制备工艺优化

黄 骞 张培雯▲ 代 晶 樊莲莲 苏文成 李林峻 曹 飞

1.四川省德阳市人民医院Ⅰ期临床研究中心，四川德阳 618000；2.成都医学院，四川成都 610500

眼内炎是白内障术后感染最严重的并发症，若发现和治疗不及时可导致视力丧失[1-2]。研究发现，眼内炎的病原体是通过穿透的手术切口带入眼内的[3]。左氧氟沙星为全合成氟喹诺酮抗菌药，对眼内炎感染的常见菌群具有良好抑菌效果[4]。近年来，利用原位凝胶的液-固相转变能力[5]，已有诸多左氧氟沙星眼用凝胶的研究报道。通常采用均匀实验设计或正交实验设计，精度与预测性较低，难以实现处方放大生产。因此，本研究拟采用非线性拟合的星点设计-效应面法对左氧氟沙星泊洛沙姆温敏型原位凝胶的处方工艺进行优化，以期达到实验目的。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（予华仪器有限公司）；NDJ-5S型数字式粘度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；数显水浴恒温震荡器（常州莆田仪器制造有限公司）；LC-2030C Plus型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 药物与试剂

盐酸左氧氟沙星（批号：2010R005073，上虞京新药业有限公司，含量：99.4%）；泊洛沙姆407（P407）（批号：GNC06921B，德国 BASF）；泊洛沙姆 188（P188）（批号：GNC10821B，德国 BASF）；盐酸左氧氟沙星对照品（批号：130455-201607，中国食品药品检定研究院）；其他试剂均为分析纯。

1.3 单因素实验

1.3.1 凝胶基质制备及胶凝温度测定 称取P407和P188粉末适量，加入低温纯化水，缓慢搅拌，置于4℃冰箱中充分溶胀，即得。取凝胶溶液置于西林瓶中，放入水浴锅中缓慢升温，每升高0.5℃观察一次胶凝情况，以胶团不流动时的温度即为胶凝温度。

1.3.2 凝胶基质对胶凝温度的影响 根据预实验结果，采用单因素法考察P188与P407浓度对胶凝温度的影响。设定P188浓度为2%，P407浓度分别为 20%、22.5%、25%、27.5%、30%；设定 P407浓度为25%，P188浓度分别为0%、2%、4%、6%、8%。

1.3.3 人工泪液稀释前后胶凝温度测定 凝胶溶液与人工泪液按体积比按40∶7的比例混合，考察混合前后的胶凝温度，模拟凝胶进入眼内的相变过程。

1.4 星点设计-效应面法优化处方

1.4.1 星点设计 参考前期研究数据[6]，左氧氟沙星对胶凝温度的影响很小。因此，选择对胶凝温度有显著影响的P407浓度（X1，%，w/v）和P188浓度（X2，%，w/v）为考察因素，极值范围：X1为20%～30%、X2为0%～8%，以模拟泪液稀释前后的胶凝温度T1、T2为考察指标，进行两因素五水平的星点设计。

1.4.2 模型拟合及数据分析 采用Design-Expert V8.0.6软件，以胶凝温度T1、T2为指标，对两个因素进行多元线性回归。根据最佳拟合模型，绘制三维效应面图和二维等高线图，并通过叠加的等高线图获取优选处方范围。计算实测值与预测值的差异，验证模型拟合的准确性。

1.5 体外溶蚀与释放实验

1.5.1 色谱条件及方法学考察 色谱条件：色谱柱Chromplus C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相磷酸二氢钾缓冲液（pH=2.2）∶乙腈=85∶15；流速1 ml/min；柱温30℃；进样量10 μl；检测波长294 nm。

精密称定盐酸左氧氟沙星对照品25 mg，加0.1 mol/L盐酸溶液定容至100 ml，即得250 μg/ml的左氧氟沙星对照液。分别精密量取1、2、3、4、5 ml对照液，加0.1 mol/L盐酸溶液定容至10 ml，考察左氧氟沙星在25～125 μg/ml浓度范围内的线性。

1.5.2 体外累积溶蚀量与释放度测定 采用无膜溶出法考察左氧氟沙星凝胶的体外溶蚀与释放行为[7]。精密量取4 ml左氧氟沙星凝胶溶液于预称重的试管中，34℃下充分胶凝，加入等温人工泪液1.5 ml，频率为100 r/min，于各时间点取样1.5 ml，并补充等量、等温泪液。样品经稀释、过滤后，取滤液进样测定浓度，并计算累积溶蚀百分率和累积释放百分率。

2 结果

2.1 P407与P188对胶凝温度的影响

图1、2结果表明，P407和P188与胶凝温度之间具有浓度依赖性。固定P407的浓度，胶凝温度随P188的浓度升高而增加，而胶凝温度与P188浓度呈正相关。进一步模拟凝胶在生理环境下的相变情况，凝胶溶液与人工泪液混合后胶凝温度下降，表明泪液会影响凝胶的形成。

图1 P407浓度对胶凝温度的影响

图2 P188浓度对胶凝温度的影响

2.2 星点设计-效应面法

2.2.1 星点设计 根据表1的因素水平安排实验，星点设计结果见表2。分析数据后，得出最佳拟合模型为二次多项拟合，方程结果：T1=104.13-5.25X1+4.41X2-0.1X1X2+0.08X12-0.031X22（R2=0.9904，P＜ 0.01），T2=153.4-7.59X1+2.87X2+0.012X1X2+0.104X12-0.16X22（R2=0.9900，P＜ 0.01）。由拟合方程的拟合优度R2及P值可知，T1和T2两种模型的拟合效果良好。模型方差分析结果显示，P407和P188对泪液稀释前后的胶凝温度均有显著影响。见表3～4。

表1 因素水平表

表2 星点设计-效应面设计安排与结果

表3 方差分析结果（T1）

表4 方差分析结果（T2）

2.2.2 效应面优化和估测 星点设计结果的三维效应面图和等高线图见图3～4；将T1、T2的等高线叠加，利用模型选择模拟T1≥25℃、T2≤34℃的交集区域，获得凝胶处方优化数学模型的最佳区域（两条等高线之间的区域），结果见图5。

图3 P407和P188对胶凝温度影响的三维效应面图

图4 P407和P188对胶凝温度影响的等高线图

图5 处方优化的二维等高线叠加图

2.2.3 处方验证 模型拟合获得优化处方配比：P407浓度为25.23%，P188浓度为1.89%。结果验证实测值为33.0℃，与预测值（36.0℃）相对偏差为2.9%（＜5%），表明预测效果良好。

2.3 体外溶蚀与释放实验

2.3.1 方法学结果 图6显示，对照溶液和左氧氟沙星凝胶溶液保留时间基本一致，凝胶基质无干扰，方法专属性良好。左氧氟沙星在25～125 μg/ml范围内线性关系良好，线性方程为Y=52969X+16783，r=0.9998。计算得到，日内峰面积RSD为0.013%，日间RSD为0.052%；平均回收率为（93.95±1.42）%（RSD=1.51%）。

图6 色谱图

2.3.2 载药凝胶体外溶蚀与释放结果 如图7所示，凝胶的累积溶蚀百分率和累积释放百分率随时间不断增加，且同一时间点累积溶蚀百分率大于累积释放百分率。采用无膜溶出法能更好地模拟眼部眨眼、泪液稀释等因素对制剂的影响[7]，本研究中泪液溶蚀是影响药物释放的主要因素。

图7 载药凝胶体外溶蚀与释放曲线

3 讨论

左氧氟沙星是氧氟沙星的左旋异构体，分子结构中含有亲水性的羧基和噁嗪环，以及疏水性的N-甲基哌嗪[8]。泊洛沙姆是一类由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（PEO-PPO-PEO）组成的两亲性共聚物[9]，P407和P188作为其中研究较多的两类材料，利用二者分子量与PEO/PPO比例不同的特点[10-11]，按照一定比例混合可获得具有反向可逆胶凝性质的温敏凝胶[12]。本研究发现P407和P188的浓度以及泪液环境均会影响胶凝温度，目前常规的均匀实验设计与正交实验设计是基于线性模型的设计，通常采用单一因素的取值方向，难以拟合多因素混合的模型[6]。因此，本研究采用星点设计-效应面法，通过描绘效应（胶凝温度）对考察因素（P407和P188的浓度）的效应面，从效应面上选择目的效应区，预测模拟泪液环境下的胶凝基质取值范围即优选处方，其精确度高、预测性好。

研究发现，结膜囊、睑缘、睫毛根部及睑板腺导管均存在大量定植菌群分布，这些细菌在手术刺激下可成为条件致病菌，进入眼内诱发感染[13-14]。目前白内障术前预防感染的主要方式为滴眼液和冲洗消毒，药物在眼部滞留时间短、易受泪液稀释，仅能减少结膜囊及眼表细菌。眼睑作为内眼手术的必经途径，手术操作中不断挤压必然会使残留在睑板腺内定植菌排出到结膜囊内，由于眼睑特殊的解剖结构，常规术前清洁消毒难以有效清除内部细菌[15]。左氧氟沙星对睑缘内主要菌群（如凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌）有良好的抑菌效果[16]，该药物尚未研制成合适的眼用制剂用于眼睑缘处的感染防治。因此，本研究制备的左氧氟沙星原位凝胶具有较理想的处方配比及较平缓的释药行为，有望成为极具潜力的产品。