GSTP1通过调节JNK通路抑制癫痫大鼠海马区星形胶质细胞炎性激活

赵增霞, 刘 波, 刘淑云, 黄正义

癫痫是由大脑神经元的异常、高度同步放电引起的一类难治的神经系统疾病[1,2]。癫痫的发病机制十分复杂,涉及一系列神经信号与突触结构的改变、细胞凋亡以及炎症过度激活等[3]。目前尚无治疗癫痫的特异性药物,并且约一半的患者因耐药导致疗效不佳[4]。近年来一些证据表明,星形胶质细胞在癫痫发生过程中扮演相当重要的角色,而通过特定机制调节星形细胞炎性激活可以改善癫痫发生[5]。谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)是体内广谱的生物转化解毒酶,具有保护细胞并防止DNA损伤的作用。既往研究报道,GSTP1在癫痫患者脑内星形胶质细胞中表达并定位于细胞质[6]。

本研究旨在明确GSTP1对星形胶质细胞炎性激活的影响及相关分子机制,以期为癫痫治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 脂多糖与茴香霉素(JNK激活剂)来自上海碧云天生物技术公司,酶联免疫吸附试验(ELISA)相关试剂盒来自上海科艾博生物公司,GSTP1过表达载体与对照载体来自上海吉玛基因公司,GSTP1、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化(p)-JNK抗体来自美国CST公司。

1.2 大鼠饲养 16只10周龄SPF 级雄性SD大鼠(体质量250～300 g)来自广东医科大学实验动物中心。饲养温度：(22±2)℃,湿度：40%～60%,光照周期：12 h/12 h,适量的水与饲料。动物实验方案已得到深圳市龙华区中心医院医学伦理委员会审批。

1.3 建立癫痫模型 大鼠被随机分为正常组与癫痫组(n=8)。癫痫组腹腔注射氯化锂(125 mg/kg),18～20 h后腹腔注射匹鲁卡品(20 mg/kg)。随后每30 min腹腔注射匹鲁卡品(10 mg/kg)一次,直至观察到癫痫持续状态。观察大鼠的行为并根据Racine标准进行评分[7],其中4～5分即为成功建模。正常组腹腔注射相同体积的0.9%生理盐水,其他操作与癫痫组相同。28 d后所有大鼠用戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后行安乐死处理,收集海马区脑组织。

1.4 细胞培养与脂多糖处理 大鼠原代星形胶质细胞采用RPMI-1640培养基与10% FBS培养,并添加2 mmol/L谷氨酰胺、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素。细胞培养条件设为37 ℃、95%空气、5% CO2。采用不同浓度脂多糖(0 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)诱导处理48 h。

1.5 细胞转染 取100 μg/ml脂多糖诱导原代星形胶质细均铺在6孔板,利用Advanced高效DNA/RNA转染试剂分别向细胞中转染4.0 μg GSTP1过表达载体与4.0 μg对照载体,48 h后收集细胞。

1.6 蛋白质印迹 提取组织与细胞中的总蛋白,取45 μg总蛋白进行电泳,并常规转膜。5%脱脂奶粉常温封闭2 h,之后4 ℃孵育抗体过夜,浓度如下：GSTP1(1∶1000稀释)、JNK(1∶1000稀释)、p-JNK(1∶2000稀释)。随后将膜与合适二抗37 ℃孵育1 h,通过超敏化学发光液检测阳性条带,并分析目的蛋白的表达情况。

1.7 ELISA 通过ELISA裂解液提取上清蛋白,取各组蛋白样本加入反应板并常温孵育1 h。随后依次加入生物素化抗体、酶结合物工作液以及显色底物。通过多功能酶标仪分析各组在450 nm波长下的吸光度值,计算肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6浓度。

1.8 谷氨酸(Glu)浓度测定 取适量组织与细胞,离心4 min后取上清,采用高效液相色谱测定Glu浓度。

1.9 拯救试验 取GSTP1过表达载体转染成功的原代星形胶质细均铺在6孔板。之后向细胞中添加10 μmol/L茴香霉素处理24 h。收集细胞,检测GSTP1、JNK、p-JNK蛋白表达水平以及TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度。

2 结 果

2.1 癫痫大鼠海马区脑组织中炎症因子与Glu浓度以及GSTP1、JNK、p-JNK蛋白表达水平 与正常大鼠组比较,癫痫大鼠组中TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度升高,GSTP1蛋白表达水平降低,p-JNK蛋白表达水平升高,差异有显著性(P均<0.05)。上述两组中JNK蛋白表达水平比较,差异无显著性(P>0.05)。GSTP1与p-JNK蛋白表达水平呈负相关(r=-0.63,P<0.05) (见图1)。

2.2 不同浓度脂多糖诱导对星形胶质细胞中炎症因子与Glu浓度的影响 脂多糖诱导后TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度呈剂量依耐性升高,差异有显著性(P<0.05),表明脂多糖可以诱导原代星形胶质细胞炎性激活(见图2)。

2.3 不同浓度脂多糖诱导对星形胶质细胞中GSTP1、JNK、p-JNK蛋白表达水平的影响 脂多糖诱导后GSTP1蛋白表达水平呈剂量依耐性降低,而p-JNK蛋白表达水平呈剂量依耐性升高,差异有显著性(P均<0.05)。上述各组中JNK蛋白表达水平没有明显变化,差异无显著性(P>0.05)。该结果表明,脂多糖可以诱导JNK通路激活(见图3)。

2.4 过表达GSTP1对脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活的影响 与对照载体组比较,GSTP1过表达载体组中GSTP1蛋白表达水平升高,p-JNK蛋白表达水平降低,TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度降低,差异有显著性(P均<0.05)。上述两组中JNK蛋白表达水平比较,差异无显著性(P>0.05)。该结果表明,过表达GSTP1抑制脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活与JNK通路激活(见图4)。

2.5 激活JNK通路对GSTP1在脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活中的作用的影响 与GSTP1过表达载体组比较,茴香霉素+GSTP1过表达载体组中p-JNK蛋白表达水平以及TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度升高,差异有显著性(P均<0.05)。上述两组中JNK蛋白表达水平比较,差异无显著性(P>0.05)。该结果表明,激活JNK通路可以部分逆转GSTP1对脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活的抑制作用(见图5)。

A：TNF-α、IL-1β、IL-6浓度升高;B：Glu浓度升高;C：GSTP1、JNK、p-JNK蛋白质印迹图;D：GSTP1蛋白表达降低;E：JNK蛋白表达无显著变化;F：p-JNK蛋白表达升高。与正常大鼠组比较*P<0.05

A：TNF-α浓度升高;B：IL-1β浓度升高;C：IL-6浓度升高;D：Glu浓度升高。1～5分别代表：0、0.1、1、10、100 μg/ml。与前一诱导浓度比较*P<0.05

A：GSTP1、JNK、p-JNK蛋白质印迹图;B：GSTP1表达降低;C：JNK蛋白表达无显著变化;D：p-JNK表达升高。与前一诱导浓度比较*P<0.05

A：GSTP1蛋白质印迹图;B：GSTP1蛋白过表达;C：过表达GSTP1降低TNF-α、IL-1β、IL-6浓度;D：过表达GSTP1降低Glu浓度;E：JNK与p-JNK蛋白质印迹图;F：过表达GSTP1不影响JNK表达;G：过表达GSTP1抑制p-JNK表达。与对照载体组比较*P<0.05

A：JNK与p-JNK蛋白质印迹图;B：茴香霉素不影响JNK表达;C：茴香霉素促进p-JNK表达;D：茴香霉素提高TNF-α、IL-1β、IL-6浓度;E：茴香霉素提高Glu浓度。与GSTP1过表达载体组比较*P<0.05

3 讨 论

越来越多的研究表明,促炎因子通过改变星形胶质细胞与神经元的交流,从而引起癫痫相关的神经元产生损伤,导致癫痫发作[8]。例如,Liyis等[9]报道高迁移率族蛋白1(HMGB1)可以诱导星形胶质细胞炎性激活,引起促炎症因子如IL-1β和TNF-α大量产生,而HMGB1抗体通过抑制P-糖蛋白表达而改善癫痫。Zhu等[10]报道髓样分化因子88(MYD88)在癫痫大鼠的星形胶质细胞中具有促炎作用,靶向MYD88可以减弱海马区神经元的损伤。此外,离子型P2X7受体(P2X7R)是炎症反应的一个重要驱动因子,靶向P2X7R可以有效对抗癫痫大鼠发作的严重程度[11]。然而阻断上述基因并不能完全治愈癫痫,说明星形胶质细胞炎性激活仍存在其他的调控途径。本研究发现,GSTP1通过调节JNK通路抑制癫痫大鼠海马区星形胶质细胞炎性激活,有助于进一步深化炎性激活介导癫痫发生的分子机制。

GTSP1基因位于人第11染色体长臂1区3带,由7个外显子组成,编码的蛋白分子量约为23 kDa。研究表明,GSTP1在维持细胞氧化平衡、调节肿瘤发生和对抗组织损伤方面起着重要作用[12,13]。最近,Wang等[14]发现具有GSTP1 rs1695位点G等位基因的癫痫儿童中由丙戊酸钠引起的谷草转氨酶异常的风险降低。与既往报道一致[15],本研究发现癫痫大鼠海马区脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度均高于正常大鼠,证实癫痫中存在炎性激活。随后通过蛋白质印迹发现,癫痫大鼠中GSTP1蛋白表达水平低于正常大鼠,与Sato等[16]报道结果相符。此外,在脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活的细胞模型中也检测到GSTP1蛋白表达水平呈剂量依耐性降低。基于以上结果,我们推测GSTP1可能参与调控星形胶质细胞炎性激活。

为了明确GSTP1在炎性激活中的作用,我们采用GSTP1过表达载体处理星形胶质细胞。结果发现TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度降低,证实过表达GSTP1抑制脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活。该结果与Bi等[17]报道的GSTP1抑制脂多糖诱导人急性单核白血病细胞的炎症反应结果一致。最近Zhang等[18]一项研究也证实GSTP1可以抑制脂多糖诱导肝脏炎症反应。此外,本研究发现癫痫大鼠中p-JNK蛋白表达水平高于正常大鼠,且GSTP1与p-JNK蛋白表达水平呈负相关。同时在脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活的细胞模型中也发现p-JNK蛋白表达水平呈剂量依耐性升高。二者结果提示,GSTP1可能调控JNK通路激活。

JNK通路参与调控多种病理生理过程,包括免疫与炎症反应、细胞增殖与凋亡、肿瘤形成与发展等[19,20]。JNK通路与癫痫发生密切相关,而p-JNK是JNK通路激活的关键效应分子[21,22]。本研究中我们观察到过表达GSTP1抑制星形胶质细胞中p-JNK表达,表明GSTP1具有抑制JNK通路激活的作用。进一步通过茴香霉素对JNK通路进行激活,发现茴香霉素可以对抗GSTP1的抑制作用,提高星形胶质细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度。该结果充分表明,激活JNK通路可以部分逆转GSTP1对脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活的抑制作用。

综上所述,GSTP1蛋白在癫痫大鼠海马区脑组织中低表达,而p-JNK蛋白高表达。过表达GSTP1抑制脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活,其分子机理与抑制JNK通路激活相关。下一步研究计划将在临床样本中验证GSTP1的功能。