罗哌卡因对脑缺血/再灌注损伤大鼠的脑保护作用及cGAS/STING通路的影响

刘 凯, 袁 帅, 孙 峰

缺血性脑血管病是指脑部血管壁病变、血流动力学障碍等引起的脑部血液供应障碍,常会引发脑组织缺血、缺氧、脑组织坏死等短暂或持久的脑损害,进而导致机体神经功能缺损[1]。随着溶栓治疗的不断发展,血流恢复后的再灌注脑损伤逐渐成为当今研究的热点[2]。脑缺血再灌注后会释放大量炎症信号,引起炎症因子大量释放及炎症细胞聚集,进而加剧脑组织受损,严重威胁患者的生命健康[3]。罗哌卡因是临床常用的局部麻醉药,具有一定的抗炎作用,可抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞的炎症反应[4],Wang[5]等研究发现罗哌卡因对脑缺血时血管内皮细胞、血脑屏障具有明显的保护作用,但关于其对脑缺血再灌注的影响报道较少。环磷酸鸟苷-腺苷合成酶(cyclic adenosine-adenosine synthase,cGAS)是核苷酸转移酶家族成员,主要通过激活膜蛋白干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon gene,STING)通路发挥作用,cGAS/STING通路激活可增加炎症细胞因子的表达[6],而抑制cGAS/STING通路可减轻缺血缺氧脑病导致的脑组织受损[7],因此本研究在前人研究的基础上探究罗哌卡因对脑缺血再灌注的保护作用及对cGAS/STING通路的影响,为临床缓解脑损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物 成年SD雄性大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号：SCXK(京) 2016-0011,SPF级,约12周龄,体重约420 g。所有大鼠按照标准条件于本院动物房中饲养,自由进食、饮水,12 h昼夜交替,相对湿度约42%,温度约25 ℃,按时清洁动物房及鼠笼。本研究经动物伦理委员会批准同意。实验过程中按照动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂及仪器 罗哌卡因、尼莫地平(货号：T0386L、T0343)购于上海陶素生化科技有限公司;HE染色试剂盒(货号：G1120)购于北京索莱宝科技有限公司;大鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL-1β)、IL-6、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)(货号：ml002859、ml037361、102828、059387、077384)购于上海酶联生物科技有限公司;兔源cGAS、STING、β-actin一抗、羊抗兔IgG二抗(货号：ab252416、ab227704、ab8227、ab150077)购于Abcam;细胞分级试剂盒(货号：AAT-60005,上海齐源生物科技有限公司);线粒体DNA分离试剂盒(货号：KA0895,艾美捷科技有限公司);酶标仪(美国Perkin Elmer公司,型号XElx800);凝胶成像仪(Miulab公司,型号：GIS-500)等。

2 方 法

2.1 动物模型制备及分组给药 大鼠脑缺血再灌注模型的制备参考文献[8]中的线栓法,将大鼠分为假手术组(8只)和造模组(40只),将大鼠用3%的异氟烷麻醉后呈仰卧位固定,大鼠颈部皮肤常规消毒后行长2 cm的切口,暴露右侧颈总动脉及分叉部,将颈内动脉及颈外动脉分离,分别用4.0号线结扎颈外动脉主干,在颈外动脉近心端离分叉3 mm处剪一小口,将尼龙线栓从切口插入颈动脉,慢慢推进,插入约18.5mm(感到阻力)时停止推进,固定尼龙线栓,缺血2 h后将尼龙线栓小心抽出,实现再灌。假手术组仅分离颈动脉,不结扎及再灌处理。大鼠苏醒后对大鼠进行神经功能缺损评分,评分为1～3分为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组、罗哌卡因低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组,每组8只。给药剂量参照人体表法计算,大鼠每日给药剂量为0.31 mg/kg,则设置罗哌卡因低、中、高剂量为0.075 mg/kg、0.15 mg/kg、0.30 mg/kg。阳性对照组腹腔注射5 mg/kg的尼莫地平[9]。假手术组及模型组腹腔注射等量生理盐水。连续干预7 d。

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分 分别在给药第0天、第3天、第7天对大鼠进行神经功能缺损评分,无神经功能缺损症状记为0分;轻微神经功能缺损症状、不能完全伸展左侧前爪记为1分;中度神经功能缺损症状、向一侧转圈记为2分;重度神经功能缺损症状、向一侧倾倒记为3分;完全不能行走、意识障碍记为4分。

2.3 大鼠脑组织获取及病理学和脑梗死面积观察 将大鼠麻醉后处死,用预冷的生理盐水灌注心脏以清除血液,4%多聚甲醛灌注后剪开脑部皮肤,取出脑组织,3只用于HE染色和脑梗死面积观察,5只用于脑组织中炎症因子、氧化应激因子及cGAS/STING通路相关蛋白表达的测定。将大鼠一半脑组织置于10%福尔马林溶液中固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切成厚约4 μm的切片,采用HE染色试剂盒进行染色后封片、干燥,于显微镜下观察并分析。将冰箱冷冻后的另一半脑组织进行连续切片(2 mm),TTC溶液染色后多聚甲醛固定(红色为正常组织,白色为梗死组织),Image J软件计算梗死面积。

2.4 大鼠脑组织中炎症因子及氧化应激因子水平检测 取适量大鼠脑组织,制成组织匀浆,离心取上清,根据TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD、MDA相关ELISA试剂盒的要求进行相关因子水平的测定。

2.5 大鼠脑组织细胞质线粒体DNA(mtDNA)水平的检测 将2.4所余脑组织进行匀浆后经细胞分级试剂盒得到细胞质成分,采用线粒体DNA分离试剂盒提取胞质中mtDNA,以其为模板采用qRT-PCR检测细胞色素C氧化酶1(cytochrome coxidase 1,CO1)表示mtDNA水平,β-actin上引为5’-ACCTTCTACAAT GAGCTGCG-3’;β-actin下引为5’-CTGGATGGCTACGTACATGG-3’mt-CO1上引为5’-GCCCCA GATATAGCATTCCC-3’;mt-CO1下引为5’-GTTCATCCTGTTCCTGCTCC-3’。

2.6 大鼠脑组织cGAS/STING通路相关蛋白表达测定 加入RIPA组织裂解液提取脑组织中总蛋白,离心后取上清,用BCA法测定其中蛋白质含量,进行电泳实验以分离蛋白,200 mA恒流下转膜90 min,8%的脱脂奶粉封闭处理,加入稀释比为1∶500的cGAS、STING、β-actin一抗,4 ℃下孵育过夜,TBST缓冲液冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗,室温环境中孵育2 h,经过显色定影后观察并拍照分析。

3 结 果

3.1 各组大鼠神经功能缺损评分 给药第0天,与假手术组相比,其余各组大鼠神经功能缺损评分显著升高(P<0.05);给药第3天、第7天,与模型组相比,罗哌卡因各剂量组及阳性对照组大鼠神经功能缺损评分显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量依赖效应,与罗哌卡因各剂量组相比,阳性对照组大鼠神经功能缺损评分降低较明显(P<0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分

3.2 各组大鼠脑组织HE染色观察 假手术组大鼠脑组织形态基本正常,无明显病变,神经细胞结构正常且排列紧密;与假手术组相比,模型组大鼠脑组织形态病变明显,神经细胞排列疏松且结构异常,细胞体积明显增大,细胞核出现偏移及空泡化现象;与模型组相比,罗哌卡因各剂量组大鼠脑组织形态均得到缓解,且呈现一定剂量依赖效应,与罗哌卡因各剂量组相比,阳性对照组大鼠脑组织缓解效果较优(见图1)。

图1 各组大鼠脑组织HE染色观察(×200)

3.3 各组大鼠脑梗死面积比较 与假手术组相比,模型组大鼠脑梗死面积(39.21±2.46) vs (0.00±0.00)显著升高(P<0.05);与模型组相比,罗哌卡因各剂量组大鼠脑梗死面积[(31.08±2.13) vs (39.21±2.46)、(23.15±2.28) vs (39.21±2.46)、(16.10±1.84) vs (39.21±2.46)]显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量效应关系;与罗哌卡因各剂量组相比,阳性对照组大鼠脑梗死面积[(10.09±1.12) vs (31.08±2.13)、(10.09±1.12) vs (23.15±2.28)、(10.09±1.12) vs (16.10±1.84)]降低效果较优(P<0.05)(见图2)。

3.4 各组大鼠脑组织炎症因子水平比较 与假手术组相比,模型组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,罗哌卡因各剂量组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量效应关系;与罗哌卡因各剂量组相比,阳性对照组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低效果较优(P<0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠脑组织炎症因子水平比较

3.5 各组大鼠脑组织胞质mtDNA水平比较 与假手术组相比,模型组大鼠脑组织胞质mtDNA水平[(4.32±0.41) vs (1.00±0.00)]显著升高(P<0.05);与模型组相比,罗哌卡因各剂量组胞质mtDNA水平[(3.43±0.30) vs (4.32±0.41)、(2.59±0.22) vs (4.32±0.41)、(1.67±0.19) vs (4.32±0.41)]显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量效应关系;与罗哌卡因各剂量组相比,阳性对照组胞质mtDNA水平[(1.05±0.10) vs (3.43±0.30)、(1.05±0.10) vs (2.59±0.22)、(1.05±0.10) vs (1.67±0.19)]降低效果较优(P<0.05)。

3.6 各组大鼠脑组织氧化应激因子水平比较 与假手术组相比,模型组大鼠脑组织中SOD水平显著降低(P<0.05),MDA水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,罗哌卡因各剂量组大鼠脑组织中SOD水平显著升高(P<0.05),MDA水平显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量效应关系;与罗哌卡因各剂量组相比,阳性对照组大鼠脑组织中SOD水平降低效果及MDA水平降低效果较优(P<0.05(见表3)。

表3 各组大鼠脑组织氧化应激因子水平比较

3.7 各组大鼠脑组织cGAS/STING通路相关蛋白表达比较 与假手术组相比,模型组大鼠脑组织中cGAS、STING蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组相比,罗哌卡因各剂量组大鼠脑组织中cGAS、STING蛋白表达显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量效应关系;与罗哌卡因各剂量组相比,阳性对照组大鼠脑组织中cGAS、STING蛋白表达降低效果较优(P<0.05)(见表4、图3)。

注：A：假手术组;B：模型组：C：罗哌卡因低剂量组;D：罗哌卡因中剂量组;E：罗哌卡因高剂量组;F：阳性对照组

表4 各组大鼠脑组织cGAS/STING通路相关蛋白表达比较

注：A：假手术组;B：模型组：C：罗哌卡因低剂量组;D：罗哌卡因中剂量组;E：罗哌卡因高剂量组;F：阳性对照组

4 讨 论

脑缺血是由脑部血流减少或暂停等多种因素导致的脑部血流供应障碍,是一种常见的急性脑血管病,脑缺血的治疗主要以增加灌注为主,脑缺血再灌注既可挽救濒死的细胞,又可释放炎症信号加重细胞损伤,进而导致脑组织受损,严重影响患者的神经功能[10～13]。因此脑缺血再灌注中炎症机制的详细研究对疾病的改善非常重要。

罗哌卡因属于长效酰胺类麻醉剂,在术后镇痛、神经阻滞麻醉、蛛网膜下腔阻滞、分娩镇痛等均有应用,具有作用时间长、清除率高等特点,同时具有一定的抗炎作用[14,15]。研究发现罗哌卡因能降低红藻氨酸引起的神经元损伤及凋亡,并显著改善模型大鼠的记忆功能[15]。罗哌卡因可通过控制氧化应激抑制高糖诱导的脑微血管内皮损伤[16]。本研究结果显示,经过罗哌卡因治疗的大鼠神经功能缺损得到缓解,脑组织受损程度显著降低,脑梗死面积、脑组织中炎症因子水平降低,脑组织中SOD水平显著升高,MDA水平显著降低,但效果不及尼莫地平,表明罗哌卡因对脑缺血再灌注引起的脑组织受损具有一定的保护作用,且其作用可能与抑制炎症因子及氧化应激反应有关。

cGAS是核苷酸转移酶家族成员,对DNA具有识别作用,脑损伤引起细胞损伤或应激反应后,可促进释放mtDNA到细胞质中,被cGAS所捕获识别,进而通过催化合成STING增加炎性细胞因子的产生并促进细胞凋亡,进而参与炎症、衰老、癌症等发生发展,与心血管疾病、神经退行性疾病等多种疾病联系密切[17]。申明琪[7]等研究发现缺血缺氧性脑病新生大鼠脑缺血后死亡细胞堆积造成DNA代谢受损,引起cGAS/STING通路激活,导致炎症细胞因子产生,进一步促进脑组织受损,而抑制该通路可减轻脑组织损伤。本研究结果显示脑缺血再灌注大鼠脑组织胞质mtDNA水平及cGAS、STING蛋白表达显著升高,经过罗哌卡因治疗后的mtDNA水平及cGAS、STING蛋白表达显著降低,提示脑缺血再灌注可导致大鼠脑组织中cGAS/STING通路的异常激活,而罗哌卡因可能通过部分抑制cGAS/STING通路,减轻炎症和氧化应激损伤,减少神经元凋亡,对脑缺血再灌注大鼠发挥脑保护作用。

综上所述,罗哌卡因对脑缺血再灌注大鼠具有一定的脑保护作用,可能与其抑制cGAS/STING通路有关。本研究仅对罗哌卡因对cGAS/STING通路的影响进行了研究,下一步试验应设置相应的通路抑制剂及激活剂进行对比实验,因此仍需深入研究。