基于数据挖掘及网络药理学探讨治疗系统性红斑狼疮经验

张开源，何诗雅，陈丽莹，姚心怡，王新昌

1.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第二医院风湿免疫科，浙江杭州 310005

系统性红斑狼疮（systemic lupuseryth ematosus，SLE）是一种以多器官、多系统损害，体内有多种自身抗体为特征的自身免疫性疾病，其主要好发于年轻育龄期妇女，男女比例可高达1:9。SLE 目前还没有根治的办法，西药治疗以抗疟药、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂为主，且常会出现各种不良反应[1]。临床实践已证实中医药治疗SLE 可以减少西药产生的不良反应，调节全身机能，有效提高患者的生活质量，具有增效减毒的作用[2]。本研究收集整理浙江中医药大学附属第二医院王新昌教授治疗SLE 的中医医案，借助数据挖掘和网络药理学对其用药规律和核心药对进行分析，以期为中医药治疗SLE 提供新的临床依据和思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

整理浙江中医药大学附属第二医院门诊病历系统中自2018 年2 月至2022 年1 月王新昌教授治疗SLE 的处方数据。①符合2009 年系统性红斑狼疮国际协作组（systemic lupus interna-tional collaboration clinics，SCLICC）制订的SLE 分类标准；②符合1994年国家中医药管理局《中医病证诊断疗效标准》红蝴蝶疮相关标准；③以服用中药汤剂为主要方法治疗SLE 的患者。排除标准：①不符合上述中西医诊断标准者；②以外用中药、西药治疗为主的病例。

1.2 方法

将检索信息录入并整理至Excel 表格，采取双人双机独立操作。中药名称规范标准参照《中国药典2020 年版》[3]为准。如将“丹皮”规范为“牡丹皮”，“浙石斛”规范为“石斛”等。①运用Excel软件进行频数分析，统计所有使用中药的频次、所属类别、四气、五味、归经等的频数与频率；②运用IBM SPSS Modeler 软件对中药进行关联分析，使用Apriori 算法，最小支持度设置为10%，最小置信度设置为80%。基于网络药理学的核心药对作用机制分析：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）、既往文献搜索生地黄、牡丹皮、赤芍的化学成分，以口服生物利用度≥30%和药物相似性≥0.18 作为筛选条件，筛选出活性成分较高的化合物。应用UniProt（http://www.uniprot.org）知识库整合蛋白靶点转化为基因标志。在GeneCards（https://www.genecards.org）数据库和OMIM（http://omim.org）数据库中检索“Systemiclupuserythematosus”，从而得到SLE 相关疾病靶点。利用Venn（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn）在线软件将三味药物与疾病的靶点取交集。将筛选得到的药物-疾病共同靶蛋白上传至STRING（https://string-db.org）在线平台数据库，应用Cytoscape3.7.2 构建蛋白相互作用网络图。使用Cytoscape 构建“中药-化合物-靶标”网络图并利用CytoHubba 计算出前4 位SLE 关键疗效基因。

2 结果

2.1 SLE 处方数据挖掘

2.1.1 用药频次与归经 对纳入的医案首诊方进行统计，共计116 首，涉及中药共176 种，累计频次共1691 次。其中使用频次≥30 的药物共有14 味。高频药物前五位依次为牡丹皮、赤芍、生地黄、白术、青蒿。对纳入处方中的中药进行归经统计，归经以肝经为最，其次为肺经、脾经。

2.1.2 常用中药类别统计 对纳入处方中的中药进行类别统计，排列得出SLE 常用中药类别：所用中药共18 类，其中药味数≥10 味的依次为补虚药（31味，17.61%）、清热药（29 味，16.48%）、解表药（15味，8.52%）、活血化瘀药（14 味7.95%）、利水渗湿药（13 味，7.39%）、理气药（10 味，5.68%）、祛风湿药（10 味，5.68%）。

2.1.3 常用药物组合关联分析 对处方中的中药进行关联分析，以支持度排序，排名前3 位的药对为赤芍-牡丹皮、生地黄-牡丹皮、生地黄-赤芍，由此可以得出生地黄-牡丹皮-赤芍为王新昌教授治疗SLE 的核心药对，见表1。

表1 常用药物组合统计

2.2 核心药对作用机制

2.2.1 “生地黄-牡丹皮-赤芍”与SLE 的交集靶点 通过数据库得到“生地黄-牡丹皮-赤芍”共同药物作用靶点406 个，从数据库获得SLE 疾病靶点1129 个，通过Venn 图交集获得115 个“药物-疾病”共同作用靶点。

2.2.2 “生地黄-牡丹皮-赤芍”蛋白互作网络 利用STRING 和Cytoscape 构建PPI 网络，并进行hub 基因分析发现STAT3、MAPK1、AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CXCL8、IL-6 等可能是核心药对治疗SLE的关键疗效靶点。

2.2.3 “中药-化合物-靶标”网络和关键疗效靶点鉴定 利用Cytoscape 构建的“中药-化合物-靶标”网络图发现网络节点176 个，相互作用关系445 条。其中来自生地黄的化合物有48 个；来自牡丹皮的化合物有2 个；来自赤芍的化合物有7 个；该药物组合有一个共同化合成分为（+）-儿茶素。使用CytoHubba 插件的Degree 算法鉴定出hub 基因：STAT3（Degree=36）、MAPK1（Degree=29）、AKT1（Degree=28）和IL-6（Degree=22）。

3 讨论

3.1 SLE 病因病机与处方规律

中医古籍中并无“系统性红斑狼疮”这一病名的记载。依据其红斑、发热与损及关节、内脏时的表现，可归属于中医“阴阳毒”“红蝴蝶疮”“痹病”、“肾脏风毒”等范畴[4]。李卫国[5]认为肝肾亏虚为本病的发病基础，热毒内伏营血是本病的病机关键，致病因素有风寒湿热瘀毒之别。尹维贤[6]认为SLE以肝肾阴虚为本，以热毒、瘀血、痰浊等为标，为本虚标实之证。王新昌教授认为SLE 以阴虚为本，热毒、瘀血、痰湿为标，本虚标实，互为因果。随着疾病的发展亦能出现阻滞气机、化火生风、耗伤气血、阴损及阳等不同的转归和预后，因此，临床上证型复杂多样，常寒热错杂，虚实夹杂。治疗上标本并治，以滋阴清热、凉血活血、健脾益气、利水化湿者为多，兼以理气、散风、解表、温阳。药物上寒温并用，多以甘缓补虚、苦燥泄热、辛散温通，以归肝经为多，兼顾肺、脾、肾、胃。药力常达于血分。SLE 患者中多为育龄期女性，且临床上SLE 常见弦脉。结合SLE 患者的生理病理特点和临床经验，认为女子属阴且阴亏者多见，而育龄期女子肝正当主时令，故将育龄期女性生机勃勃的特点与春季万物生发的特性相类比，提出“关键病位在肝”的见解。从卫气营血角度看，SLE 多为血分病变，肝属血分，以上论述均强调了肝的重要地位。通过对SLE 病机的充分认知及对病情的精准把控辨证用药，使药力常达于血分，具有良好的临床疗效，并提出了“关键病位在肝，以调肝复圆为要”的新见解。

3.2 核心药对初步分析

牡丹皮、生地黄为温病经典药对。《温病条辨》[7]记载太阴伏暑，舌赤口渴，无汗者，为邪在血分而表实，用银翘散加生地、丹皮、赤芍、麦冬。《湿热论》[8]治湿热证，上下失血，或汗血，毒邪中入营分，走窜欲泄，用大剂量犀角、生地、丹皮、赤芍等。三者功效相近，常相须为用共奏清热凉血之功。一项基于329 例中医药治疗的数据挖掘结果表明，热毒、血瘀、阴虚是的基本病因病机，清热药、补虚药、活血化瘀药位居治疗药物前3 位，这类药物可能作用于腺苷酸活化蛋白激酶、酶磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 等信号通路，其中包括“生地黄-牡丹皮-赤芍”的药物组合[9]。一项关于合并皮肤损害的276 例处方用药规律分析表明，生地黄、牡丹皮、赤芍是治疗皮肤损害的主要药物，其主要通过环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号、钙信号等通路发挥关键作用[10]，由此可知，生地黄-牡丹皮-赤芍药对始终贯穿疾病治疗的全过程，三药合治狼疮有相得益彰之功。

3.3 核心药对机制探讨

生地黄是临证中治疗频次最高的药物之一。通过中药治疗含生地黄处方用药规律分析后发现，其多用生地黄为主的滋补肝肾阴津之法扶正，清热凉血解毒之法祛邪，兼以活血化瘀之品[11]。现代药理学研究表明，生地黄表现出显著的抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等多重功效。以生地黄为君药的复方生地合剂，被用于阴虚内热证患者的治疗，其能够抑制TLR-MyD88-NF-κB 信号传导，从而改善MRL/Lpr 系统性红斑狼疮小鼠Th17/Treg 细胞失衡[12]。槲皮素与山柰酚均是中药牡丹皮的主要疗效靶点。两者均具有抗炎、抗氧化、调节免疫、抗氧化应激等功能。

（+）-儿茶素是该核心药物中共同治疗的潜在活性成分，儿茶素通过调节胸腺T 淋巴细胞增殖及细胞介质水平，恢复T 细胞亚群的平衡从而发挥免疫细胞的正常功能，具有抗炎、调节免疫等作用。之后进一步通过网络药理学的方法对核心药对治疗的起效机制进行探讨与分析，构建了蛋白质互作网络后鉴定出以下四种枢纽靶点：①信号传导及转录激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）：STAT3 是一种能够介导细胞对白细胞介素等生长因子反应的信号转导器和转录激活因子。STAT 上游的Janus 激酶（activation of janus kinases，JAK）是一类胞内非受体酪氨酸激酶家族，JAK 与其受体的结合导致受体细胞质部分的构象改变，启动与受体相关JAK 的激活。随后，JAKs介导特定受体酪氨酸残基的磷酸化，使之成为二聚体，从而进入核转录[13]。JAK-STAT 信号通路几乎介导了所有免疫调节过程，异常的JAK-STAT 信号被认为与免疫紊乱、炎症状态和自身免疫性疾病有关[14]。STAT3 磷酸化可以介导干扰素α 对SLE 中的B 细胞起到分化和活化的作用，表明STAT3 对SLE 的疾病进展起到了关键作用[15]。②白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）：IL-6 是急性期反应的有效诱导剂，其主要作用于B 细胞、T 细胞、肝细胞、造血祖细胞和中枢神经系统细胞，主要参与淋巴细胞和单核细胞的分化，尤其在B 细胞向Ig-分泌细胞的最终分化中起重要作用。SLE 患者中IL-6 的表达水平显著升高，且IL-6 的表达水平与C 反应蛋白显著相关[16]。③丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（serine/threonineprotein kinase B，AKT1）：AKT1 它能够调节细胞增殖和血管生成等许多过程。磷脂酰肌醇3（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）活化后能够激活AKT 信号，转导AKT 激酶从而调控SLE 的发病过程。AKT1 是PI3K信号通路的关键下游靶点，且在外周血B 细胞和T细胞的分化中起细胞内稳态的作用[17]。B 细胞稳态紊乱与SLE 密切相关。PI3K-AKT 和JAK-STAT 通路的过度激活可能导致SLE 中趋化因子受体4 的失调，而趋化因子受体4 水平失调在SLEB 细胞中与疾病活动度和肾脏受累程度相关[18]。一项网络药理学研究也验证了PI3K-AKT 与“生地黄-牡丹皮-赤芍”药对的相关性[9]。④丝裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1）：MAPK1 和MAPK3 是级联中发挥重要作用的两个MAPKs。根据细胞环境的不同，MAPK 级联反应通过调节转录、翻译、细胞骨架重排从而影响细胞生长、黏附、存活和分化等多种生物学功能。有研究证明，SLE 外周血单个核细胞的MAPK1 的表达水平与辅助性T 细胞1、调节性T 细胞和白细胞介素10 的表达水平显著相关[16]。且有研究结果表明，“生地黄-牡丹皮-赤芍”药对治疗SLE 的机制可能是通过MAPK 信号通路[9]。

本研究利用数据挖掘技术将临床上模糊、繁杂、不规范的临床医案进行规范化、标准化处理，总结SLE 临床用药规律，对核心药对生地黄-牡丹皮-赤芍治疗SLE 的化学成分、关键靶点和作用通路进行研究。生地黄-牡丹皮-赤芍三药合治狼疮有相得益彰之功，但其影响SLE 疾病发生、发展的作用机制仍有待进一步的临床、细胞与动物实验验证。