献血者HCV筛查及确认试验结果分析

许雷 马维娟 张志杰 张龙穆

2015年全球7 100万人有慢性HCV感染，我国一般人群抗-HCV阳性率约为0.60%[1]，自从1998年实现无偿献血和HCV筛查以来，献血人群HCV感染率大幅下降。现用于血液筛查HCV感染的指标包括血清学和HCV RNA检测，HCV RNA检测是丙型肝炎早期诊断最有效指标，但在丙型肝炎感染者中HCV RNA可以由阳性转阴性或波动性出现，病毒载量极低的情况下（血液HCV RNA检测阴性）仍有造成输血传播的风险[2]。目前国内采供血机构多数通过检测血清抗-HCV结合核酸检测来判断是否有HCV的感染[3-5]。用于血液筛查的抗-HCV试剂主要有：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）间接法和双抗原夹心法，有研究指出，不同厂家抗-HCV试剂的灵敏度和特异性有明显差异[6]。《血站技术操作规程》（2019版）规定可采用一遍血清学一遍核酸进行血液HCV筛查，评价选择符合采供血机构需求的血清学检测试剂，可以更好地发挥酶免检测与核酸检测的互补效果，更好地为临床提供安全合格血液。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2019年1—12月青岛地区献血者标本119 602人例进行抗-HCV检测，留取部分抗-HCV反应性标本（61例）进行补充实验，其中单试剂反应性46例，双试剂反应性15例。采用EDTA- K2分离胶抗凝真空采血管（美国BD公司），采血管在采血后4 h内离心，1 100 r/min离心15 min后保存于2～8℃冰箱，核酸检测完标本置于-30℃冰箱冻存，以备进行补充和确认试验。

1.2 方法

1.2.1 血清学检测方法

使用哈美顿全自动加样仪STAR（瑞士Hamilton公司）、哈美顿全自动酶免分析仪 FAME （瑞士Hamilton公司）进行血清学检测。抗- HCV ELISA 间接法试剂包括：Murex HCV ELISA（美国，以下简称a试剂）；新创抗-HCV检测试剂（厦门，以下简称 b试剂）；Ortho HCV 3.0 ELISA（美国，以下简称c试剂）；丽珠抗-HCV检测试剂（珠海，以下简称 d试剂）。ELISA夹心法试剂：万泰第4代ELISA 检测试剂（北京，以下简称夹心法试剂）。血清学确证试剂使用万泰HCV确证试剂（北京，简称RIBA）。

1.2.2 核酸检测方法

使用Procleix Panther核酸检测系统（西班牙盖立复）及其检测试剂Procleix Elite；罗氏Cobas s 201核酸检测系统（美国罗氏）及Cobas MPX 2.0检测试剂进行核酸检测。

1.3 观察指标

1.3.1 ELISA检测

STAR全自动加样仪加样，采用全自动酶免分析标仪FAME进行两种试剂两次检测，按仪器和试剂盒的要求进行操作。应用夹心法试剂对61例标本进行再次检测，按试剂使用说明书，450/630 nm 波长下比色读取吸光度值（optical density，OD），样本S/Co值≥1判断为反应性，样本S/Co＜1判定为非反应性。

1.3.2 NAT检测

Panther检测系统采用单人份检测模式，S/Co值≥1 判断为反应性，样本S/CO值＜1判定为非反应性，初次检测有反应性的标本进行项目鉴别实验。Cobas s 201检测系统采用6人例混样检测模式，经初次检测无反应性的标本判为阴性，初次检测有反应性进行拆分实验，循环数阈值（cycle threshold，Ct值）＜60为阳性，Ct值无显示为阴性。

1.3.3 补充确认试验

对61例标本进行RIBA法和RNA检测，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。其中RIBA确认试剂按照使用说明书至少2条带≥1+为阳性，1条带≥1+为可疑，没有≥1+条带为阴性，确认试剂中出现一次阳性判为确认阳性。确认试验RIBA阳性（RIBA+）和（或）HCV RNA阳性（RNA+）的样本判定HCV真阳性，RIBA试剂均不确定且HCV RNA阴性（RIBA IND /RNA-）的判为不确定，RIBA和HCV RNA阴性判定为真阴性样本。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，不同试剂之间抗-HCV阳性率以n（%）表示，比较采用χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗-HCV初筛（间接法）反应性

表1显示，抗-HCV间接法试剂初筛检测献血者标本119 602人例，反应性210例（1.76‰），其中单试剂反应性187例（1.56‰），占比89.05%（187/210）。进口间接法试剂反应性比例高于国产试剂（a试剂 VS b试剂、c试剂 VS d试剂），差异均有统计学意义（χ2=20.525、39.321，P＜0.05）。

2.2 2种试剂与确证结果的符合性

本研究留取的61例初筛反应性标本中，确认试验阳性标本14例（RIBA+/RNA+ 9例 、RIBA+/RNA- 5例），确认阴性标本40例（RIBA-/RNA-）（另外7例为RIBA IND/RNA-，按不符合统计，表2）。

表2 2种试剂检测结果与RIBA确证结果的符合情况（例）

2.3 2种试剂与确证试验（RIBA及HCV RNA）结果对比

表3显示，本研究留取的36例间接法（c试剂）反应性标本，夹心法试剂检测反应性16例，其中HCV RNA或RIBA确证阳性14例，1例为RIBA确证不确定，1例阴性。其余20例初筛单试剂反应性标本，夹心法试剂检测为非反应性，RIBA确证结果15例为阴性，5例为不确定。

表3 两种试剂检测结果不一致标本的确认试验结果（例）

3 讨论

HCV主要通过输血及血液制品传播，也可经破损的皮肤和黏膜传播，HCV病毒颗粒结构区包括：核心蛋白基因区（C区）和衣壳蛋白基因区（E1，E2）；非结构区包括：NS2、NS3、NS4、NS5。HCV血液筛查试剂大体上分为三类：血清学检测HCV抗体的ELISA试剂（间接法/夹心法）、血清学检测HCV抗原的ELISA试剂、利用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）或核酸扩增-转录介导的扩增技术（transcription mediated amplification，TMA）等方法检测HCV RNA的核酸检测试剂等。虽然近年来HCV抗体的检测敏感性得到很大的提高，但仍存在“窗口期”较长的问题，我国自2010年开始，在采供血机构中引进核酸检测，有效缩短了献血者HCV筛查的“窗口期”[7]，从2015年血液筛查核酸检测全面覆盖，使我国输血后HCV感染的残余风险度下降到万分之一以下[8]。但由于HCV病毒特点区别于HBV和HIV，HCV核酸检测能力偏弱，存在漏检风险。结果显示抗-HCV筛查双试剂反应性的15例标本，RIBA确证试验阳性14例，核酸检测阳性仅9例，即其余5例RIBA确认结果阳性，而献血者HCV RNA未能检出，与相关报道结果相近[5]，可能存在HCV既往感染，抑或隐匿性感染：血液中HCV RNA水平低于核酸检测下限，表现为HCV RNA阴性[3]，也可能造成HCV输血传播风险，因此血液筛查核酸检测不能完全替代血清学检测。

HCV核心抗原几乎与HCV RNA 同时出现，同样具有弥补血液筛查“窗口期”漏检的优势[9]，但灵敏度比核酸检测偏低，笔者认为更适合在未开展核酸检测的地区进行大规模的血液筛查。有研究比较发现Murex Ag/Ab对抗体检测的敏感性不如间接法Murex Ab试剂[10]，可能试剂微孔板包被的抗原或抗体性质有关。笔者认为我国血液筛查已全面核酸检测的背景下，应用灵敏度较低的HCV Ag/Ab联合试剂的意义不大，应着重考虑敏感性和/或特异性更好抗-HCV试剂结合核酸检测进行血液筛查。

抗-HCV试剂从第一代仅包被NS4抗原片段，到第三代试剂（间接法）包被核心（结构区）和NS3、NS4、NS5（非结构区），增加了核心区C33的比重，因此敏感性大大提高，但仍未解决假阳性高的问题。结果显示，c试剂单试剂反应性标本经核酸检测全部阴性；RIBA确认试验不确定5例，阴性15例。间接法单试剂阳性标本无确认阳性者，结合表1数据推断，不论是进口还是国产试剂，间接法假阳性率明显偏高，可能原因是血清中非特异性免疫球蛋白G（IgG）、类风湿因子干扰、超氧化物歧化酶干扰、用于试剂制备的抗原不纯等因素均可造成假阳性[11]。较高的假阳性率不仅浪费宝贵的血液资源，也给献血者造成不必要的困扰，因此对抗-HCV初筛反应性献血者，应制定合理归队策略。

表1 2019年无偿献血者标本抗-HCV血液筛查情况

夹心法抗-HCV试剂（第4代）在检测抗-HCV IgG的基础上，增加了免疫球蛋白M（IgM）的检测，不仅可以缩短窗口期，主要是将基因工程重组表达的抗原作为原料取代了酶标二抗，方法学上有了大幅改进，理论上可以大大提高检测特异性。而且待检样本加样量由间接法的10μL提高到50μL，降低了加样误差造成漏检的可能。笔者对留取的61例间接法试剂（间接法）初筛阳性标本用夹心法试剂检测，反应性17例，初筛试验间接法双试剂反应性的15例样本全部检出（确认结果阳性或不确定），说明其灵敏度能够满足采供血机构血液筛查的要求。其中46例间接法单试剂反应性标本中，仅有2例夹心法试剂检测为反应性（确认结果阴性和不确定各1例），说明夹心法试剂的特异性明显高于间接法试剂。在血液筛查中采用双抗原夹心法试剂可以有效地降低假阳性率，为血液筛查工作提供更高的准确度，可以减少血液浪费，也避免为献血者带来不必要的心理负担。

由本研究确认试验结果可以看出双试剂阳性的标本，其确证阳性的概率很高，留取的双试剂阳性的标本15例，确认阳性14例（93.33%，14/15），而单试剂阳性的标本确证试验阳性率较低。c试剂单试剂反应性标本确认试验（RIBA）不确定样本7例，主要以c22核心区条带和NS3抗原条带弱反应性为主，笔者认为假反应性概率较大，相关文献报道抗-HCV确证结果为不确定的标本检测的S/Co值分别＞8.0时预测为阳性献血者的概率较大[12]。而这7例样本用夹心法试剂检测均为非反应性，这可能与试剂厂家包被抗原种类和工艺水平有关，这7例标本ELISA检测的S/Co值普遍较弱，不排除假反应性的可能。表3中的5例不确定标本，反应条带普遍较弱，且核酸检测结果全部阴性，对于此类人群是否有HCV传播风险，有待进一步进行随访和评估[6]。

综上所述，笔者认为双抗原夹心法（4代）抗-HCV血筛试剂灵敏度可靠，特异性明显高于间接法试剂。献血者HCV筛查中，核酸检测不能完全取代血清学检测，二者应相互补充，如果采用一遍酶免和一遍核酸的HCV筛查模式，采供血机构应根据本地区HCV流行情况合理选择血筛酶免和核酸试剂组合，提高血液筛查检测效能。针对抗-HCV初筛反应性献血者，应进一步优化归队策略，为献血者提供后续随访和合理的就诊建议，对献血者及时告知和关爱[13]，文章的研究结果可为献血者归队策略指南的进一步优化提供数据参考。