氧化应激在感音神经性耳聋中的作用机制

王香香 孙建军 刁明芳

1 活性氧的产生和作用机制

氧化应激是指机体细胞内氧化与抗氧化失衡的状态，倾向于氧化。氧化应激过程中产生的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是一大类基于氧的含有未配对电子的原子或原子团，其化学性质不稳定，易接收或释放不成对电子而形成稳定结构，主要包括氧自由基和含氧非自由基活性物质，其生理量可调节机体内正常功能，但在某些病理情况下，机体ROS产生过多或抗氧化防御系统受损导致活性氧蓄积，可引起组织细胞损伤和功能障碍[1]。目前认为线粒体是细胞内产生ROS的主要部位，因为细胞总耗氧量的90%～95%来自于线粒体，且在还原为H2O的过程中，约有0.1%～2%的氧气部分还原，诱导产生ROS[2]。

ROS对生物大分子有损伤作用，具有极强的氧化能力，过度积累会导致DNA损伤、蛋白质变性和脂质过氧化等。①ROS可对DNA碱基进行氧化修饰、破坏DNA脱氧核糖中C-H键、分解核苷酸等。与核DNA不同，线粒体DNA（mtDNA）由于缺乏保护性组蛋白，对氧化损伤尤其敏感。此外，线粒体电子传递系统（ROS产生的位点）与mtDNA的附着位置（线粒体内膜侧）接近，造成mtDNA必须在ROS不断损伤下修复[3]；②ROS对蛋白质的影响包括氨基酸残基的修饰、肽链的断裂、蛋白质交联，从而破坏蛋白质的正常功能。在过渡金属Fe或Cu存在的情况下，H2O2可转变为活性作用更强的自由基·HO，进而产生更为剧烈的氧化反应；③ROS可直接氧化不饱和脂肪酸，显著改变膜和其他脂质结构，从而改变膜的流动性、渗透性，干扰物质运输，且对于线粒体膜的损伤可直接干扰细胞内ATP的生成[4]。且脂质过氧化反应产生多种化学性质相对稳定的副产物，如丙二醛、壬烯酸、丙烯醛和异前列腺素等[5]，这些氧化产物不仅直接引起细胞凋亡，还能共价修改重要的生物大分子，使蛋白质和DNA发生交联，诱导细胞凋亡或死亡。除此之外，过量的ROS还可进一步促使炎性细胞因子的生成，加剧细胞损伤[6]。

2 氧化应激和内耳疾病

2.1 噪声引起的听力损失

噪声性聋（noise-induced hearing loss，NIHL）的其听力学特征是4000 Hz处听阈提高最明显。噪声引起的听力损失的机制除了毛细胞表皮板纤毛束的机械损伤外[7]，更重要的是过量ROS的作用[8]：噪声过度刺激增加了毛细胞中机械感觉立体纤毛的位移速度，从而开放机械敏感通道，钾离子大量内流，增加了线粒体对ATP合成的需求。换言之，在强噪声暴露时，耳蜗淋巴液振动转换成神经电冲动的过程需要毛细胞线粒体超负荷生产ATP，此过程同时会产生大量的副产物-ROS；噪声导致的耳蜗缺血后再灌注，也会进一步增加ROS的产生；此外，过度噪声刺激引起毛细胞释放大量谷氨酸神经递质，也可能通过对初级感觉神经元产生兴奋性毒性而导致损伤。

自由基的产生已通过检测活性氧、代谢产物水平以及抗氧化剂在预防听力损失中的有效作用得到证明。暴露于强噪声后，可立即观察到ROS的生成，远远早于检测到损伤的形态学表现，并在噪声暴露结束后持续7～10天[9]。噪声暴露后ROS诱导的脂质过氧化产物能引起细胞凋亡，且血管活性脂质过氧化产物（即异丙醇）能使耳蜗血流量减少[10]。另外，啮齿动物模型中通过增加谷胱甘肽水平治疗NIHL，与未治疗的动物相比，治疗组动物的耳蜗损伤显著减少[11]。同样噪声暴露后给予N-乙酰半胱氨酸可最大限度地减少实验动物毛细胞的凋亡进程，明显降低中低频听觉阈值偏移[12]。一项随机双盲试验[13]发现，依布硒啉（基于硒的有机化合物，能够模拟和增强体内谷胱甘肽过氧化酶1的活性）在预防成人急性噪声性听力损失方面是安全有效的。信号转导和转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）是一种应激反应性转录因子，在氧化应激介导的组织损伤中起关键作用。使用STAT3抑制剂可抑制STAT3信号通路，降低外毛细胞中ROS水平，防止噪声暴露引起的耳蜗毛细胞损伤和听力损失[14]。

近年来，随着精准医学的不断发展，多组学技术被广泛用于疾病研究。其中相较于基因组学和蛋白质组学，代谢物的种类和数量少且易获得，基因和蛋白表达的有效微小变化也会在代谢物上得以放大；另外，基因表达的结果可能需要数小时才能表现出来，而代谢变化能更加迅速的反映出来；且代谢物是各因素效应的最终体现，与生物表型变化有直接相关性。Fujita等[15]研究了强噪声暴露（126 dB SPL）对豚鼠耳蜗外淋巴中代谢物水平的影响，发现暴露于噪声后，内耳外淋巴中的十种代谢物水平发生显著变化，而血浆中的代谢物水平没有变化。且这10种代谢产物中抗坏血酸的水平差异最大。抗坏血酸在生理上是一种水溶性小分子抗氧化剂，可有效清除超氧物、硫醇、单线态O2和羟基自由基。之前研究也发现不能合成抗坏血酸的SMP30/GML基因敲除小鼠内耳螺旋神经节细胞数量减少，听觉脑干反应阈值增加[16]。Ji等[17]进一步收集小鼠颞骨组织，通过靶向代谢组学对220种代谢物进行分析，鉴定了40种受噪声影响的代谢物，检测到与氧化应激相关的代谢物和途径，证实噪声暴露和氧化应激之间存在一定联系。

2.2 耳毒性药物引起的听力下降

耳毒性药物主要包括氨基糖苷类抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn）和铂类抗癌药物，这两类药物通过凋亡途径产生ROS损伤Corti’s器毛细胞。AmAn是广谱抗生素，兼有耳毒性和肾毒性[18]。肾毒性通常是可逆的，因为肾脏近曲小管的细胞可以增殖并修复，而耳毒性造成的耳蜗毛细胞受损为不可逆性。AmAn可能通过触发不同的凋亡信号损害耳蜗外毛细胞[19]。此外，与位于耳蜗顶回处理低频声音的毛细胞相比，位于耳蜗底回处理高频声音的毛细胞更易受损[20]。因此，AmAn的使用需要对适应症进行仔细的临床评估。ROS现已被确定为AmAn引起听力损失的主要因素。AmAn易积聚在毛细胞的线粒体中，庆大霉素直接抑制线粒体核糖体中蛋白质的合成，并触发线粒体通透性转换孔开放[21]。AmAn在全身给药后，可存在于内耳组织中长达6个月或更久时间，进入外毛细胞催化不饱和脂肪酸产生ROS[22]。以链霉素为例[8]，链霉素进入细胞内与铁鳌合，形成链霉素-铁复合物，与电子供体不饱和脂肪酸(如花生四烯酸)发生反应形成大量过氧化物阴离子和羟自由基，损伤线粒体膜性物质，线粒体功能障碍又进一步导致内耳大量氧自由基产生和抗氧化物酶过度消耗，诱导耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞凋亡或死亡。这也是临床上使用铁螯合剂(如去铁胺和二羟基苯甲酸盐)治疗药物性耳聋的原因，可减少耳毒性药物对铁的利用，实现对耳蜗组织的保护；此外动物实验表明[23]，在AmAn的暴露下，过量表达超氧化物清除酶的动物较对照组表现出较少耳毒性。在新霉素诱导的耳毒性小鼠中，抗氧化剂芍药苷通过抑制细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）的激活，缓解线粒体凋亡途径的失衡，达到降低细胞ROS水平，实现减少细胞凋亡，减低新霉素对耳蜗毛细胞损伤的作用[24]。这些研究证据直接或间接表明氧化应激参与药物性聋的发生。

顺铂在肿瘤细胞中充当DNA交联剂，其铂原子与嘌呤碱基结合并抑制细胞增殖，从而使细胞周期失活并导致肿瘤细胞凋亡[25]。经静脉注射顺铂后，在耳蜗组织中持续滞留时间可达数月甚至数年，而在其他组织器官中经数天或数周即可被清除[26]。顺铂诱导耳蜗ROS的产生，不仅通过增加耳蜗特异性ROS产生酶，如NADPH氧化酶（NADPH oxidases，NOX）、黄嘌呤氧化酶的活性，还通过降低内源性抗氧化酶系统的活性[27]，常见的机制包括[28]：①顺铂共价结合抗氧化酶的巯基，导致酶活性丧失；②超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH.Px)活化所必需的金属辅助因子（如铜和硒等）丢失；③ROS增加需要消耗更多的抗氧化酶；④耳蜗内抗氧化物酶GSH.Px和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）活化必需的辅助因子过度消耗，如谷胱甘肽（glutathione，GSH），NADPH等。ROS增多最终导致细胞凋亡和坏死，抑制ROS可以改善听力损失。暴露于顺铂的大鼠，其耳蜗显示GSH耗尽，抗氧化酶（如SOD、GSH.Px、GR等）活性降低及脂质过氧化证据增加[29]。在暴露于顺铂之前用抗氧化剂α-硫辛酸预处理可以显著防止耳蜗细胞中ROS的积累并保护听觉功能，且证实α-硫辛酸发挥保护作用是通过激活Nrf2/HO-1通路减轻内耳损伤，而核转录因子Nrf2正是细胞内抗氧化系统的核心成员，不仅是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，也是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者[30]。

2.3 年龄相关性聋

年龄相关性聋（age-related hearing loss，ARHL）临床上又称老年性聋。听力减退多从高频听力开始，并逐渐发展到中低频听力，累及言语频率，与耳蜗从基底部到顶端的逐渐退变有关。ARHL的特征是双耳对称性缓慢听力下降，其特点为听觉敏感度和语言理解能力降低。受影响的耳蜗结构主要包括血管纹及其脉管系统，螺旋韧带纤维细胞，感觉毛细胞和听觉神经元。

老年性聋的病因是随着年龄增长的过程中所有可导致听敏度下降因素的总和，如听觉系统自然老化、噪声暴露、使用耳毒性药物、外伤、血管损伤、代谢变化、激素、饮食和免疫系统等多方面效应的叠加[31]。氧化应激在老年性聋发病过程中起关键作用[32]。造成机体氧化和抗氧化失衡的原因为主要来自两个方面：一是随着年龄增长，内耳ROS产生增多。线粒体作为ROS的主要来源在老化过程中发挥关键作用[33]。这一理论得到了线粒体抗氧化基因SOD2或线粒体铁调节蛋白Frataxin过度表达显著增加果蝇寿命的观察结果的支持[34]。衰老应激中，线粒体DNA缺失或突变，从而导致ROS过度累积，而过量积累的ROS攻击靶点线粒体：①影响线粒体呼吸链复合物的活力，使线粒体氧化磷酸化合成ATP的功能受损；②引起线粒体膜结构上蛋白质和脂质过氧化，改变生物膜通透性，释放Ca2+和细胞损伤因子，最终导致细胞凋亡[35]。ROS增多和线粒体损伤互为因果。导致失衡的另一个原因是随着年龄增长，机体组织清除ROS的能力逐渐下降[36]。内源性抗氧化剂GSH随年龄增长其合成减少。Jiang等[37]以CAB/J衰老雄性小鼠作为研究对象，通过对超氧化物歧化酶和凋亡诱导因子进行组织化学分析和蛋白免疫印迹检测，发现其在Corti’s器和螺旋神经节中的表达随着年龄的增长而减少。发现相较于3月龄年轻Fischer344大鼠，24个月龄的老年大鼠，其听神经细胞中GSH表达水平降低了86%[38]。一些研究已经在与老年性耳聋相关的ROS信号基因中寻找基因变体，但尚未确定[39]。然而，易受氧化应激影响的动物模型显示出一系列与衰老相关的表型：阻断编码铜/锌超氧化物歧化酶1的表达可加速ARHL的发病[40]，线粒体过氧化氢酶的过度表达则可减少DNA氧化损伤和毛细胞丢失，并防止ARHL[41]。基于耳蜗组织对ROS的反应性，一些研究小组试图通过添加外源性抗氧化剂预防或改善ARHL。抗氧化剂包括直接抗氧化剂比如α-硫辛酸、N-乙酰半胱氨酸和辅酶(Co)Q10,可以直接跟ROS反应降低氧化应激；间接抗氧化剂，如酚类化合物和营养物质,可以激活细胞氧化还原酶[42]。但治疗结果各不相同，可能是由于抗氧化剂剂量或输送方式的差异造成。氧化失衡确实参与了老年性耳聋的发生发展。

2.4 突发性感音神经性耳聋

突发性感音神经性耳聋（sudden sensorinural hearing loss，SSNHL）的发病机制尚不清楚，因无法进行组织病理学检查使其病因学研究受到限制。近年来，研究者将注意力集中在耳蜗微循环上，由于供给内耳血液的迷路动脉是末梢动脉，血液黏度增加或者内皮功能障碍均会影响耳蜗血流灌注导致Corti’s器官功能障碍[43]。研究强调了氧化应激作为不同血管疾病中微血管损伤的风险因素。Becatti等[44]首次研究红细胞氧化应激与SSNHL患者血液粘度增加的相互关系，发现SSNHL患者的红细胞膜结构和功能发生了显著改变，膜脂质过氧化水平和细胞内ROS生成水平升高，认为ROS诱导的红细胞结构功能改变参与SSNHL病理过程，这可能是一个新的治疗靶点。另外，氧化应激与内皮功能障碍之间的关系也已在多项研究中得到证实[45]。当ROS过量时，会耗尽细胞内的NO水平，增加粘附分子（P-选择素）、脂质炎症介质（如血小板活化因子、白三烯B4）和细胞因子（如IL-8）的表达，从而导致内皮功能障碍[46]。2019年，美国SSNHL临床实践指南中，在建议不使用的干预措施列表中将抗氧化剂删除[47]，表明抗氧化剂在治疗SSNHL方面可能具有潜在价值。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸联合地塞米松可能通过保护毛细胞提高SSNHL患者的听力恢复率[48]；同样，一项临床试验[49]表明，补锌可通过降低耳蜗的氧化应激促进SSNHL患者的听力恢复。尽管在SSNHL患者中发现存在氧化剂-抗氧化剂失衡的证据，但抗氧化剂作为治疗靶点及作用机制尚难以阐明。

综上所述，活性氧相关的组织损伤是导致听力损失的途径之一，但目前许多观点尚不能达成一致，未来的研究依赖于更精准的分析，包括代谢组学、蛋白质组学、基因组学和转录组学等，以充分了解听力损失的发生机制。已经明确的是，抗氧化治疗对噪声、机体老化和耳毒性药物引起的听力损失具有一定防治作用。但是全身应用抗氧化剂不具备靶向性，且可能干扰其他组织细胞的正常氧化和抗氧化平衡。故抗氧化治疗选择何种药物、如何联合用药及探索最佳给药方式等将成为以后研究的主要方向。