臭牡丹提取物凝胶剂肛肠药效学及体外释药性研究

张蜀艳，李奕霏，焦乾辰，李春梅，邹立扣

1成都工业职业技术学院，成都 610051；2西安交通大学，西安 710048；3西北农林科技大学，西安 712100；4四川农业大学，成都 611130

臭牡丹（Clerodendrum bungei Steud.）为马鞭草科大青属的植物，外形酷似牡丹，有恶臭味，故名。喜阳光充足和湿润环境，适应性强，生长范围广。《本草纲目拾遗》［1］记载：“洗痔疮治疔赤水元珠：苍耳、臭牡丹各一大握，捣烂，新汲水调服，泻下黑水即愈。 一切痈疽淳安陈老医云：用臭牡丹枝叶捣烂，罨之立消。”提示臭牡丹可用于治疗痈疽、痔疮等，具有解痉镇痛、抗惊厥、抗炎、抗溃疡、抗菌及解热等多种药理作用［2］，民间采取水煮、酒精浸泡等方式后外敷用以治疗皮肤溃烂。前期研究表明，臭牡丹提取物可提高小鼠免疫功能，对6种常见病菌（酵母菌、伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌、金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、白色念珠菌）有较明显的灭活作用［2］，并可改善免疫低下小鼠的免疫功能［3-4］。

臭牡丹在中药治疗皮肤溃烂进程中始终占有重要位置，且已有上千年历史。现代研究表明臭牡丹对溃疡性痔疮有较好的治疗作用［4］，但其科学验证一直较为匮乏。为了弘扬民族文化，促进中药的古法今用，本研究进行了动物药理学和药效学研究，验证臭牡丹的疗效，以期为开发臭牡丹提取物凝胶剂用于溃疡性痔疮的补充治疗和研究治疗痔疮的中药新药制剂提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物［5-6］

成年SPF级KM小鼠共50 只（雌雄各半），8周龄，体重20～24g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK（川）2015-030， SYXK（川）2015-196。本实验经本院实验动物管理委员会批准（伦理批号：202001001），按照3R原则给予试验动物人道主义关怀。

1.2 主要仪器与试剂

Nexera LC-40高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV1900紫外可见光检测仪（日本岛津公司）；微孔滤膜滤过器和针式过滤器（天津市精拓仪器科技有限公司）；AUV120型电子天平（日本岛津公司）；PHS-3C台式酸度计（山西信伟慧诚科技有限公司）；NDJ-1ZH8890型六速旋转粘度计（北京中慧天诚科技有限公司）；79HW-1型恒温磁力搅拌器 （中国浙江乐成电器厂）；VGT17-PS-20T超声波清洗器 （北京海富达科技有限公司）；DHG-9030/DHG-9030A电热鼓风干燥箱（北京海天友诚科技有限公司）；半透膜扩散池（自制）；RE-201D 旋转蒸发仪（郑州特尔仪器设备有限公司）；ZLGJ-18压盖多岐管型冻干机（华辰仪器有限公司）；BKQ-Z301高压蒸汽灭菌器（山东博科科学仪器有限公司）；GZP-250B光照培养箱（绍兴市景迈仪器设备有限公司）；GDW/GDJS-100高低温（交变）试验箱（上海苏盈试验仪器有限公司）；TDL-5-A低速大容量离心机（爱来宝医疗科技有限公司）。

臭牡丹提取物对照品（本实验室提供）；马应龙麝香痔疮膏（中国马应龙药业集团股份有限公司，国药准字Z42021920）；卡波姆940（武汉德晟生化科技有限公司，批号：1806005，99.9%医药级）；1, 2-丙二醇（河南钦荣化工产品有限公司，批号：1910003，纯度99%）；无水甲醇（中国天津市首世化工有限公司，批号：1811006，纯度100%）；氢氧化钠（中国天津市首世化工有限公司，批号：1905002）；盐酸（中国济南春禄福商贸有限公司，批号：1705002）；冰醋酸（天津市永大化学试剂有限公司，批号：1705004，纯度99%）。

臭牡丹原植株采集地为四川省成都市，采集时间为2018年7～8月，由青山利康药业有限公司执业药师刘小英鉴定为臭牡丹。

1.3 正交试验优化制备工艺［7-8］

采集7～8月的新鲜臭牡丹植物全株（包括叶、茎、根），洗净，加水10L，煎煮1h后过滤，再重复煎煮2次，合并3次药液。采用75%乙醇沉淀，超真空蒸馏后再进一步冷冻干燥得到冻干品，经过Sevage法除蛋白、透析后得到相对分子质量在8000u以上的物质，即为主药。称取双蒸水50g于烧杯中，加入适量卡波姆940，溶胀24h，加入10g主药混匀，然后加入适量丙二醇、无水乙醇，用NaOH调节pH至7.2，补充双蒸水至100g，装罐灭菌处理后得到样品，即为臭牡丹提取物凝胶剂（下文简称CBS）。其中，以卡波姆940、丙二醇、无水乙醇为因素，采用正交实验法优化CBS的制备工艺，因素水平见表1。

空白基质：称取3份100g双蒸水，分别加入1.2、1.5、1.8g卡波姆940，溶胀24h，得到不同浓度的空白基质。

1.4 质量评价［9］

外观：黄褐色半固体，稠度适宜，涂展性好，质地均匀细腻，吸收快。

pH：取CBS样品溶解到适量双蒸水中，pH为7.2。

强光照射试验及稳定性试验：取CBS样品放置于光照培养箱中，以4500LX培养15天；另取CBS样品10g，4000r/min离心45min。均无渗水分层现象。

高温高湿耐寒试验：取适量CBS样品于瓶内密闭，置于药品稳定性试验箱中，设置湿度为75%，温度为55℃，放置24h；另取CBS样品置于冰箱（0℃）中放置24h。均无分层和霉变现象。

1.5 动物药效学研究［10-11］

将小鼠随机分为空白组、模型组、基质组、对照组与样品组，每组各10只，且雌雄各半。除空白组外，其余4组均采用冰醋酸（acetic acid，HAC）建立溃疡性痔疮小鼠模型：在每只小鼠肛门内推入HAC 0.2ml，首剂量为5%，保持1min后用棉签沾出，连续给药3天。

动物模型建立后，各组给药方案见表2。按表2剂量在小鼠肛门内分别推入卡波姆940、马应龙麝香痔疮膏（MYL）、CBS，保持1min后用棉签沾出，连续给药7天后处死小鼠，在距肛门相同距离（1cm） 处取同一部位组织（2mm×10mm），采用4%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片（4μm）后进行HE染色，盲法阅片，观察其组织学损伤程度及修复情况。

1.6 体外释药性研究［12-13］

1.6.1 色谱条件

SunFire C18色谱柱；流动相为30%甲醇；流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为510nm；保留时间为30min；进样体积为10μl。

检测波长的选择。取臭牡丹提取物适量，加30%甲醇振摇溶解，采用紫外分光光度计进行200～600nm波长全扫描，最大吸收波长为507nm及512nm，经预试并结合文献报道［8］，选择510nm为检测波长。

1.6.2 测定方法

用猪小肠作为半透膜制作成扩散池模拟肛门环境，半透膜与供应室之间放置高0.50cm、直径3.6cm、内圆面积为10.1736cm2的环形塑料圈，透析膜置于供应室与接受室之间（相对分子质量＜14000的物质CBS可通过该膜微孔），进行释药性测定。在37.5℃恒温水浴中加入磁力搅拌转子匀速搅拌（30r/min），准确称量CBS 3.0g紧密填放于供应室中，接受室中加入40ml 37.5℃的蒸馏水，分别于1、2、3、4、6 h取出接受池中溶液0.6ml（立即补充等体积37.5℃蒸馏水），并用30%的甲醇液稀释至2ml，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为待测液。另准确称取臭牡丹提取物对照品0.1g，用100ml 30%的甲醇溶液溶解定容，作为对照品溶液。分别取已稀释的待测溶液和对照品溶液10μl，按“1.6.1”项下方法进行测定，根据结果计算单位面积累积药物释放量。

采用随行标准单点比较法计算供试品中臭牡丹提取物的含量，再按照下式计算出单位面积累积渗透量：

式中，Q为第n次取样时的单位面积累积渗透量；V为接受池的体积；Cn为第n个取样点测得的药物浓度（μg/ml）；Vi为第i个取样溶液的体积（0.6ml）；Ci为第i（i≤n-1）个取样点测得的药物浓度（μg/ml）；A为扩散渗透面积（cm2）。以Q值为纵坐标，时间t为横坐标进行线性回归，其斜率即为透皮速率常数 J [μg /（cm2·h ）]。

1.7 统计学方法［14］

采用SPSS Statistics 19.0软件处理数据，结果采用±s表示，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 正交试验优选制备工艺

正交试验结果见表3。由表3的极差分析结果可知，RB＞RA＞RC，提示3个因素对收得率的影响大小依次为：丙二醇（B）＞卡波姆940（A）＞无水乙醇（C）。在试验设计范围内，优化得到最佳处方方案为B1A3C3，即各成份配比为丙二醇（0.0ml）、卡波姆 940（1.8g）、无水乙醇（10.0ml）时，该处方外观性状和黏度均符合标准，且成本较低，故选择该处方做进一步研究。

2.2 质量评价

CBS的外观为黄褐色半固体，稠度适宜，涂展性好，质地均匀细腻，吸收快；pH为7.2，适合肛门特殊环境使用；经强光照射试验、稳定性试验及高温高湿耐寒试验，均无渗水分层现象和霉变现象。表明本处方物理化学性质较为稳定。

2.3 动物药效学研究［15-16］

动物药效学研究结果表明，基质组和模型组有大量炎性渗出物，黏膜上形成较多的溃疡灶，组织间隙明显水肿，腺体结构模糊；样品组和对照组无渗出物，未见溃疡和脓灶，黏膜、黏膜下层及肌浆层均完整，无明显病变，结果见表4和图1。

2.4 体外释药性研究［17-18］

按照“1.6”项下方法进行测定。由于肛门处的体液环境中性略偏碱性，为了考察CBS的释药机制，仅选择双蒸水（pH = 7.0）为溶出介质，尽量避免其他物质的干扰，使结果更有准确性。在不同时间点进行取样，测定在相同工艺条件下制备的3批CBS不同时间的累积药物释放量并探索其释药机制。结果显示，3批CBS的释药动力学过程符合Higuchi释药模型，提示其释药曲线呈线性关系，药物释放以扩散方式为主，累积药物释放量结果见表5，累积释药曲线见图2。

3 讨论与结论

在前期研究基础上，本研究确定卡波姆940为凝胶剂基质；为减少对肛门皮肤的刺激、增加基质黏合度，确定处方pH为7.2。保湿剂丙二醇对处方的影响较大，且肛门无保湿要求，结合正交试验结果，故处方取消丙二醇。通过质量评价、动物药效学和体外释药性研究确定处方具有较好的外观和黏度、涂敷分散、皮肤耦合性好、药物滞留时间长、药效持久、耐热耐寒、性质稳定、释药快且经济合理，储藏要求可相对宽松。

研究结果显示，模型组小鼠于模型建立3天后出现稀便及血便，并伴有明显体重下降，表明溃疡性痔疮小鼠模型成功建立。对照组和样品组连续治疗7天，发现小鼠体重下降幅度逐渐减缓并转而呈上升趋势，且大便性状好转。组织学检查结果显示，基质组和模型组有大量炎性渗出物，黏膜上形成较多的溃疡灶，组织间隙明显水肿，腺体结构模糊；样品组和对照组无渗出物，未见溃疡和脓灶，黏膜下层及肌浆层均完整，无明显病变，提示CBS和MYL对小鼠的肛肠溃疡具有一定的抗溃疡和修复作用，可有效促进伤口的愈合、细胞的生长及受损细胞的修复，且二者对HAC诱导的小鼠溃疡和脓灶有相似的疗效。《本草纲目拾遗》记载臭牡丹可用于治疗痈疽、痔疮等；《福建药物志》（第二卷·修订本）［19］记载臭牡丹可“活血散瘀，拔毒消痈”。本研究验证了臭牡丹对于溃疡性痔疮有较好疗效，但仍存在不足，主药单体成份还需要进一步提纯分析，确定其分子结构，为精确处方提供依据。

体外释药性研究考察发现，累积药物释放量与时间呈线性关系，表明该制剂有良好的释药能力，但总体来说药物释放的时间较长、释放量不够多。为避免刺激肛门、促进药物在弱碱性肛门环境中的释放，建议在用NaOH调节pH时，应使 pH=7.2［20］。

综上所述，在弱碱性条件下，CBS能快速到达痔疮的病灶靶点，其疗效与临床常用、具有确切疗效的MYL基本持平，建议后期对臭牡丹有效成份进一步提纯分析，优化提纯和分析方法，同时进行毒理试验，为臭牡丹相关制剂的开发奠定基础，为古方今用提供思路。