扩展性无创产前筛查在胎儿微缺失/微重复综合征中的应用*

郭梨梨 韩 玉 翟敬芳1,*

1.蚌埠医学院研究生院 (安徽 蚌埠 233000)

2.徐州医科大学徐州临床学院 (江苏 徐州 221009)

3.徐州市中心医院产前诊断中心 (江苏 徐州 221009)

染色体疾病是出生缺陷人群最常见的遗传病，其中非整倍体的发生与同源染色体不分离有关，随着女性妊娠年龄的增加，胎儿非整倍体的发生率增加[1]，但染色体微缺失、微重复的发生与妊娠年龄无关[2-3]。随着对染色体微缺失/微重复综合征(chromosome microdeletion/microduplication syndromes, MMS)的深入研究，微缺失、微重复综合征文献报道的种类超过300种，累积发病率约为1.0-2.5%[4-7]，即使在结构正常染色体核型正常的胎儿中拷贝数变异累计发生率为1～1.7%。微缺失/微重复综合征具有复杂的临床表现如特殊面容、精神行为改变等[8]，常合并生长发育异常、智力缺陷，生活不能自理，给社会及家庭带来极大的危害。相关指南推荐对妊娠妇女进行相关筛查[4]，美国医学遗传学会(ACMG)推荐无创产前筛查(Non-invasive prenatal screening, NIPS)对年轻孕妇进行22q11缺失综合征筛查[9]，但传统的NIPS局限于21三体、18三体、13三体及性染色体，对胎儿染色体微缺失/微重复筛查的效能低，侵入性产前诊断需要人力及实验室条件要求，扩展性无创产前基因筛查(expanded noninvasive prenatal screening, NIPS-Plus)能够满足临床对胎儿染色体微缺失及微重复筛查的需要，现将其在胎儿染色体微缺失及微重复中的应用情况作一综述。

1 NIPS-Plus技术原理及实验流程

NIPS-Plus是NIPS检测升级版，也是基于高通量测序技术原理对母体外周血胎儿游离DNA进行序列测定。相对NIPS而言，NIPS-Plus在测序数据量和算法方面做了很大改进，使检测范围更加广泛，临床价值高于NIPS[10-11]。NIPS-Plus测序深度较NIPS增加2～3倍(～0.4 X，reads数量为800万条)，有更好的检测性能[12]。NIPS-Plus技术实验流程与NIPS相似，包括血浆DNA提取分离、DNA文库构建、文库扩增及上机测序分析三个过程，实验流程按照实验室相关规定的标准操作规程(SOP)进行，对测序结果进行分析判断， 不同公司的检测方法使用的测序平台、实验方案、测序方法以及纳入的样本量及测序数据量等方面存在差异，但均具有较高的灵敏度和特异度。

2 质量控制程序

NIPS-Plus实验室质控严格遵循相关规范指南[13-14]。首先，采样前超声检测证实为活胎，医生需与孕妇进行充分的知情告知NIPS-Plus检测指征以及局限性如染色体平衡易位、多倍体等。同时，注意排查可能存在明显影响结果准确性的情况如干细胞治疗、1年内接受过异体输血等。按照规定的采样管进行样本收集，条型码确保唯一，血浆无严重溶血。如系院外检测，血浆及DNA 样本采用干冰运输，短期保存-20℃，超过7天需在-80℃保存，以上均为检测前质控。

检测过程质量控制：有资质的检测人员应在具备NIFTY环评标准实验室按照标准操作规程进行实验。使用经CFDA批准的体外诊断试剂盒，设置空白对照和阴阳性对照，使用Qubit荧光定量仪进行文库定量质量控制，对检测结果阳性的临床样本应对该样本进行再次验证。报告生成环节需在系统信息完成审核、分析等检测后质控环节，同时应加强对NIPS-Plus发现的阳性、阴性及检测失败病例的管理。国内大多数实验室采用的是NextSeq CN500 (Illumina)和 BGISEQ-500平台，不同的平台产生的reads数及有效数据量有不同的要求。

3 NIPS-Plus检测效能及适用人群

从理论上来说，NIPS-Plus能够检测出预设阈值以上的微缺失、微重复片段，但由于母体外周血胎儿浓度、测序所覆盖的深度等不同，NIPS-Plus对具体的微缺失微重复检测的效能不同[15-16]。关于NIPS在产前筛查中的应用早在2015年国际产前诊断协会(International Society forPrenatal Diagnosis，ISPD)推荐NIPS检测适用于全人群产前筛查[17]，2020年美国妇产科医师学会(american college of obstetricians and gynecologists，ACOG)推荐NIPS可替代传统血清学筛查作为全人群产前筛查的首选项目，而不建议进行多种产前血清学筛查方法，但提醒临床医师无论筛查结果如何，所有筛查孕妇都需要进行超声检查[18]。对于胎儿染色体拷贝数方面的研究，2016年美国医学遗传学会推荐NIPS对年轻孕妇进行22q11缺失综合征筛查[9]，2020年广东省精准医学应用学组推荐NIPS对致病明确的微缺失微重复片段进行NIPS筛查[19]。NIPS对拷贝数变异(copy number variations,CNVs)的检出率较低，NIPS-Plus在对CNVs检出彰显其优势[9]。与NIPS比较，梁德生等学者基于2015年至2018年对94085例大样本孕妇NIPSPlus检测发现对胎儿非整倍体(13、18、21、性染色体)和MMs筛查的特异度均大于99%，对Digeorge的阳性预测值(positive predictive value, PPV)93%，接近T21筛查的阳性预测值95%，对22q11.22重复综合征、prder - willi /Angleman和Cri du Chat综合征的PPV也在50%以上，推荐NIPS-Plus作为一线的筛查方法应用于临床[6]。另外，广州妇女儿童医学遗传中心应用对7710例选择NIPS-Plus妊娠妇女与42969例妊娠妇女进行NIPS的对比研究发现，对于不同大小的拷贝数变异，如DiGeorge综合征、Prader Willi综合征、猫叫综合征等，NIPS-Plus均展现出明显的优势，NIPS-Plus的检出率提高了1.02% (0.58% vs 1.60%)，>10Mb的CNVs的PPV明显高于NIPS组(P<0.05)，NIPS- Plus较NIPS检测的总PPV 明显比NIPS高(43.61% vs 30.96%)[12]。

NIPS-Plus检测的理论基础与NIPS相似，均是胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cff-DNA)，因此两种检测方法的适用人群相似，可以参照国卫办妇幼发〔2016〕45号文件关于适用人群、慎用人群及禁用人群的规定[13]。2015～2018年在一项42910例大样本研究中，NIPS无论在以临界高风险为主的适用人群还是在高龄和超声软指标异常及血清学高风险人群中，对21三体均有较高的预测价值，PPV高达70%以上，最高达100%；在超声结构异常的禁用人群中，18三体和CNVs的PPV均达到了100%[7]，而后者常合并胎儿结构异常，因此胎儿结构异常中染色体非整倍体和微缺失微重复的概率增高，这一点与大多数文献报道一致[20]。陈艺升等人研究发现NIPS-Plus临床检测指征中，高龄PPV(77.8%)最高，对血清学筛查高风险或处于临界风险、超声软指标或结构异常的PPV分别为55.1%、73.9%[21]。陆娄恺奕等人对1312例IVF孕妇进行了NIPS与NIPS-Plus复合检测，发现NIPS及NIPS-Plus对体外受精与胚胎移植(invitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)胎儿的非整倍体筛查的PPV均超过80%，这说明NIPS-Plus对IVF-ET妊娠人群筛查具有一定的应用价值[22]。但丁昭宁等通过研究认为NIPS-Plus在CNVs的检测中对常见染色体疾病如21、18-三体的检测中阳性预测值较高，而在微缺失/微重复、性染色体异常等检测中阳性预测值尚需进一步提高[23]。

4 NIPS-Plus技术临床应用优势

NIPS-Plus是一种升级版的胎儿染色体拷贝数变异筛查技术，通过增加测序深度、扩大检测范围对胎儿染色体拷贝数变异进行筛查。NIPS-Plus技术检测的范围更加全面，可以发现多种胎儿染色体异常，包括21、18及13-三体的24种常染色体非整倍体疾病、4种性染色体非整倍体疾病、百余种>3Mb的胎儿染色体缺失/重复综合征[22-24]。吴梦诗等于2021年总结中提出对于染色体微缺失发生频繁高的年轻女性，建议进行 NIPS-Plus筛查[25]。2021年郑州大学第一附属医院产前诊断中心通过对64135例妊娠妇女11～14周进行NIPS与NIPS-Plus对比检测，并同步结合超声筛查，证实了NIPS-Plus不仅对常规的非整倍体筛查具有很好的临床应用潜力，而且对在妊娠早期超声筛查中没有异常的MMS也具有临床检测效能[26]，推荐超声和NIPS- Plus结合后续的遗传咨询可以作为对所有孕妇的一种全面的一线筛查方法。2022年最新研究表明NIPS-Plus对高龄孕妇的胎儿SCAs和染色体非整倍体筛查方面优于年轻孕妇[27]。对于NIPS对于高龄妊娠人群中的研究发现，与孕产妇的年龄呈负相关[28]，但cffDNA含量与孕龄呈正相关，由于NIPS-Plus对cffDNA有较高的富集程度，NIPS-Plus更适合作为高龄孕妇的早期筛查手段。

5 NIPS-Plus技术的局限性

临床医师在使用NIPS-Plus之前，需要深入了解该技术的局限性，方便对检测结果的遗传咨询和后期随访处理。NIPS-Plus PPV和阴性预测值受到研究过程中多种因素的影响，随着基因组CNVs数量的增加，假阳性和阴性结果预计会增加。随着测序深度的增加，NIPS-Plus势必检测出更多的微缺失微重复片段[12]，临床上进行产前诊断对意义不明的拷贝数变异一方面增加了产前诊断成本，另一方面无疑增加了产前诊断咨询的难度，其中NIPSPlus检测出的小于5～10Mb的染色体变异，但对于未发生基因剂量变化的染色体结构异常无法判断[29]，以上这些都需要后续的实践和研究来提高其准确性。另外，由于母体因素、胎盘滋养层细胞、性染色体互换因素、限制性胎盘嵌合等因素可能会导致假阳性及假阴性结果的出现[16]。与NIPS相比，NIPS-Plus目前检测费用较高，一定程度上限制了其在临床上的广泛应用。

6 总结及发展前景

总而言之，微缺失/微重复综合征临床发病率较高，NIPSPlus对胎儿拷贝数变异检测不是确诊的手段，但其能一定程度上满足临床对胎儿染色体微缺失及微重复筛查的需要，缓解临床产前诊断的压力，实现了更加全面的出生前对胎儿染色体筛查。随着分子检测技术的发展，越来越多的孕妇倾向于选择NIPS。同时，随着测序价格的降低，NIPS-Plus有望成为孕妇首选的一线产前筛查技术。但仍需要对NIPS-Plus应用产前筛查方面做深入的研究,使其在指导优生优育方面有更近一步的突破。