叶酸改善卵泡液中同型半胱氨酸水平和氧化应激反应对卵母细胞发育潜能的影响

郑可欣，张 宁

（1.滨州医学院第二临床医学院，山东 烟台 264003 ；2.烟台毓璜顶医院生殖医学科，山东 烟台 264099）

在辅助生殖治疗过程中，获得具有受精能力和发育潜能的优质卵母细胞对妊娠结局至关重要[1]。在卵泡生长发育过程中，卵泡液为卵母细胞提供了特殊的内分泌营养环境。异常的卵泡组成可影响卵母细胞的生长、发育和成熟。在卵母细胞发育过程中，卵泡液中的氧化应激现象可造成卵母细胞线粒体的损伤、三磷酸腺苷（ATP）缺乏、减数分裂异常和染色体非整倍体数目增加，进而损害卵母细胞的发育潜能[2]。同型半胱氨酸的主要不良作用为引起或加重氧化应激现象，导致卵母细胞发育潜能降低。叶酸作为一碳单位载体参与DNA、RNA、蛋白质的合成，具有促进甲基化反应、细胞分裂、核酸合成以及抗氧化的作用，可防止卵母细胞氧化损伤，促进卵母细胞减数分裂和成熟，保证卵母细胞的遗传稳定性。补充叶酸可减轻同型半胱氨酸和氧化应激反应对卵母细胞的损伤，从而提高卵母细胞的发育潜能，增加辅助生育治疗的成功率。

1 氧化应激

1.1 氧化应激现象

活性氧(reactive oxygen species，ROS) 是生物体内活性含氧化合物的总称，包括超氧自由基、过氧化氢、羟自由基等。在卵母细胞及胚胎发育的微环境中，由氧气参与新陈代谢所产生的活性氧如得不到及时清除，会诱导氧化应激的现象[2]。在辅助生殖过程中活性氧的产生主要来自两方面：（1）由配子和胚胎自身代谢产生，相关反应过程包括氧化磷酸化和细胞凋亡；（2）在周围环境因素的影响下产生，影响因素包括培养基中氧气浓度、吸烟、年龄和可导致生育力低下的疾病〔包括子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）、早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）等〕[3-4]。正常生理条件下，机体的氧化/ 抗氧化水平处于动态平衡状态。ROS 会在体内不断产生和被清除，这使ROS 浓度处于动态平衡状态。当机体抵抗ROS 的能力下降时，相关动态平衡就会被打破，导致细胞功能异常[5]。在辅助生殖过程中，细胞氧化代谢产物无法被及时清除，且体外培养的环境会进一步诱发氧化应激反应，导致过量ROS 蓄积，可引起一系列病理状态，包括生物膜脂质损伤、糖化氧化、DNA 损伤、蛋白质过氧化等，导致细胞凋亡、组织器官损伤和各种疾病的发生[6]。

1.2 氧化应激对卵母细胞发育潜能的影响

机体中ROS 和抗氧化剂可保持一种平衡。生理浓度范围内的ROS 是卵母细胞成熟、排卵、黄体化、黄体孕酮产生和单卵泡形成所必需的物质[7-8]。当平衡被打破，过量的ROS 会诱发氧化应激，导致卵母细胞老化[9]；同时，过量的ROS 与胚胎碎裂增加、胚胎分裂减少和囊胚形成率降低有关[10]，它可通过造成DNA 损伤、线粒体改变、脂质过氧化和蛋白质氧化来影响未成熟卵母细胞细胞核和细胞质的成熟，从而降低胚胎的发育潜力[11]。在体外培养过程中，卵母细胞和胚胎不可避免地会暴露在光照和比体内更高的氧浓度下，这可能导致过量ROS 的产生，进而引起氧化损伤，影响卵母细胞和胚胎的正常发育。清除体内过多的ROS 对卵母细胞成熟和胚胎发育至关重要[12]。Das 等[13]从78 名接受控制性卵巢刺激的输卵管性不孕患者的体内采集了208 份卵泡液样品，并对其进行了ROS 和脂质过氧化物(lipid hydroperoxide，LPO)分析，结果显示卵泡液中高水平的ROS 会降低卵母细胞的受精潜力，卵泡液中ROS 及LPO 的水平与胚胎质量呈负相关。体内氧化应激水平可以通过相应标记物的水平反映，标记物包括三类：（1）氧化产物类：包括丙二醛（malondialdehyde，MDA）、晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products，AOPP)、巯基蛋白；（2）抗氧化酶：包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 等；（3）总氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）指标。机体抗氧化系统中的氧自由基可以攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化。MDA 是脂质过氧化过程中活性最高的非自由基中间体和终产物，其主要衍生出活性羰基物质。研究表明，高水平的MDA 可降低卵母细胞的成熟率，影响受精能力，导致卵母细胞发育潜力下降、高质量胚胎减少以及不良临床妊娠结局的产生[14]。AOPP 是反映人体氧化应激引起的蛋白质损伤的可靠指标。巯基蛋白可以保持氧化还原状态，发挥防止氧化损伤的作用[15]。它可诱导还原型谷胱甘肽（glutathione reduced，GSH）的合成，提高配子中GSH 的浓度，促进胚胎发育至囊胚阶段[16]。有研究者提出，卵泡液中最重要的抗氧化酶是SOD。研究发现，SOD 浓度及活性较高的卵母细胞具有更高的受精率与卵裂率，形成的胚胎移植后临床妊娠率更高[17]。Paszkowski 等[10]的研究已证实卵泡液TAC 与卵母细胞成熟率呈正相关，可作为预测人类体外受精成功的指标。Chattopadhayay 等[18]研究指出，在多囊卵巢综合征患者中，未成熟卵母细胞卵泡液中的TAC 水平低于成熟卵母细胞。Oyawoye 等[19]的研究表明，较高的TAC 水平可提高接受体外受精女性的受精潜力。Mojtaba Kafi 等[20]的研究则证实，将MDA 作为氧化应激标志物的效果比TAC 更好。目前TAC 与卵母细胞发育和辅助生殖技术结果之间的关系仍有很大争议。Oyawoye 等[21]研究发现，低TAC 与卵子受精不全相关，而与胚胎活力无关。在多囊卵巢综合征患者中，受精不全与TAC 升高相关。

2 同型半胱氨酸

2.1 同型半胱氨酸的代谢

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代谢过程中的中间产物，在体内有甲基化和转硫两条代谢途径，前者使Hcy 重新获得甲基转化为甲硫氨酸，后者则经胱硫醚作用生成半胱氨酸。Hcy代谢过程中有三个关键酶：亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、胱硫醚p.合成酶(cystathionine βsynthase，CBS) 及甲硫氨酸合成酶(methionine synthetase，Ms)[22]。目前学者们认为，体内Hcy 水平主要受参与蛋氨酸代谢过程中的三种酶的影响，另外各种辅因子( 如钴胺素、维生素B6、叶酸) 也对其水平有一定影响[23]。

2.2 Hcy 对卵母细胞发育潜能的影响

Hcy 的主要不良作用是产生活性氧(ROS)，导致细胞分裂减少，产生炎性细胞因子，改变一氧化氮代谢，增加氧化应激，增加细胞凋亡，并导致甲基化紊乱[24]。卵泡液Hcy 浓度与卵子受精率、卵裂率、优质胚胎率呈显著负相关关系，卵母细胞成熟率会随着卵泡液中Hcy 浓度的降低而增加[25-26]。卵泡液Hcy水平与卵母细胞质量呈负相关[27]；在受精方面，随着卵泡液中Hcy 浓度的增加，受精率下降。此外，卵泡液中的Hcy 浓度与卵泡直径呈负相关，提示卵泡液中Hcy 浓度过高会抑制卵泡的生长，并可能影响卵母细胞的成熟和受精[28]。董丽霞等[29]的研究表明，PCOS患者采卵日血浆和卵泡液中Hcy 的浓度明显高于非PCOS 患者（P＜0.05），血浆中Hcy 的浓度与卵泡液中Hcy 的浓度呈正相关，卵泡液中Hcy 的浓度与受精率、卵裂率和优胚率呈负相关（P＜0.01）。Luting Chen 等[30]的一项研究表明，在IVF/ICSI 周期中，Hcy 与临床妊娠和着床率呈高度负相关，尤其是在携带MTHFR C677T TT 基因型的女性中。Y Razi 等[31]的研究表明，卵母细胞成熟率＜80% 的女性其卵泡液中Hcy 的浓度高于9.8 μmol/L，大多数优质胚胎为Hcy 水平＜9.8 μmol/L 的胚胎。降低卵泡液中的Hcy 浓度可以显著提高卵母细胞成熟率和胚胎质量。另外，衰老可能是通过增加卵泡液中Hcy 水平导致胚胎质量和卵母细胞成熟率下降的间接因素。卵泡液中Hcy 浓度的升高可刺激氧自由基的产生，降低机体的抗氧化能力[32]。其还可以通过干扰体内的转甲基化反应来影响DNA、RNA、蛋白质的合成，从而影响细胞的发育和分化[33]。Priscila Queiroz D’Elia 等[34]的一项前瞻性研究证明在卵泡发育中，高Hcy 血症可激活细胞凋亡，导致卵泡闭锁，影响卵母细胞的成熟和体外培养胚胎的质量。超阈值Hcy 可能对卵母细胞具有细胞毒性和基因毒性作用，导致卵母细胞的细胞核或细胞质发生光镜无法观察到的异常变化，从而降低卵母细胞质量和发育潜力，影响胚胎着床和正常妊娠的维持[29]。

3 叶酸

3.1 叶酸的代谢

叶酸又称维生素B9，在体内可被二氢叶酸还原酶还原成为二氢叶酸，继而还原成为四氢叶酸。四氢叶酸是一碳单位的传递体，容易接受或脱离一碳单位(甲基、次甲基、亚甲基、甲烯基) 参与DNA 修复和其他功能。四氢叶酸加甲基后变为10- 甲酰四氢叶酸，之后在10- 甲酰四氢叶酸脱氢酶的作用下变为5，10-亚甲基四氢叶酸，再经MTHFR 作用形成6S-5- 甲基四氢叶酸[35]。叶酸可作为一碳单位载体参与DNA、RNA、蛋白质的合成，具有促进细胞分裂、甲基化反应、核酸合成和抗氧化的作用。在对卵母细胞发育的影响方面，叶酸具有促进卵母细胞减数分裂和成熟，保证卵母细胞遗传稳定和防止卵母细胞氧化损伤的作用，是胚胎发育过程中必不可少的营养物质[36]。

3.2 叶酸对Hcy 的改善

植入前的胚胎在很大程度上依赖于在卵母细胞生长过程中获得的内源性还原叶酸池的再循环，主要用于合成嘌呤和嘧啶[37]。叶酸缺乏会影响DNA 甲基化和完整性，增加血液Hcy 水平。卵泡液中Hcy 水平升高与形成不成熟的卵母细胞和质量差的胚胎相关，而MTHFR 基因变异与卵巢储备降低、卵泡刺激反应减弱和体外受精后活产机会减少相关。携带多种MTHFR 变体的胚胎似乎具有选择性劣势，研究表明叶酸代谢和相关基因变异的不平衡可能会损害女性的生 育 能 力[38]。Wiesław Szymański 等[39]的 研 究 结 果显示，在补充叶酸的较低Hcy 浓度的一组女性中，第一级和第二级成熟度卵母细胞的比例较高，补充叶酸降低了卵泡液和血清中Hcy 的浓度。暴露在低浓度Hcy 下的卵母细胞有更好的质量和更高的成熟度。一项对于卵泡液中适合卵母细胞发育的叶酸和Hcy 浓度的多因素Logistic 回归分析显示，卵泡液中叶酸浓度＜14.25 ng/mL 和Hcy ＜4.9nmol/mL 分别是优质胚胎和临床妊娠的潜在预测指标[40]。Brouwer IA 等[41]的研究表明，健康的年轻女性除日常饮食摄入叶酸外，补充250 μg/d 的叶酸可显著降低其血浆总Hcy 的浓度。Jolanda CBoxmeer 等[28]的研究表明，卵巢刺激可导致血液Hcy 的水平显著降低(P ≤0.001)。Hcy 和叶酸在血液中的浓度与其在卵泡液中的浓度密切相关(P ≤0.001)。在补充叶酸的女性中，卵泡液叶酸水平与卵泡直径呈负相关(P ≤0.05)，提示卵泡液中过多的叶酸可能对卵泡发育产生不利影响。

3.3 叶酸对氧化应激现象的改善

一项对相关随机对照试验的系统回顾和荟萃分析表明，补充叶酸可通过增加血清中GSH 和TAC 的浓度来降低血清中MDA 的浓度[42]。此外，叶酸可通过降低ROS 的蓄积来调节卵巢对促性腺激素的反应，从而影响卵巢刺激治疗的结果[43]。叶酸可通过增加细胞内的内在抗氧化剂水平使细胞免受氧化应激的伤害。此外，来自叶酸代谢的不同分子对DNA、RNA、蛋白质合成、适当的表观遗传活动和染色体结构维护也是必不可少的，这使得叶酸在细胞快速生长和增殖期间（包括生殖细胞成熟、怀孕和受精等过程）不可或缺[44]。

4 总结与展望

卵泡液中的氧化应激反应与Hcy 可通过各种机制影响卵母细胞的发育，研究表明补充叶酸可以改善它们的不利影响，提高卵母细胞的发育潜能。然而，补充过多的叶酸则会起到相反的作用。未来需要更多的随机对照试验来确定叶酸的相关临床疗效，探索叶酸提高卵母细胞发育潜能的最适浓度，并通过与个人的叶酸代谢能力相结合来个性化地制定补充叶酸的剂量，以期提高辅助生育的成功率。