泛耐药铜绿假单胞菌菌株广谱噬菌体裂解酶的获取及抗菌活性观察

王猛，蔡大敏 ，王景雨，王策，邵煜涵，穆红

1 南开大学附属天津市第一中心医院检验科，天津 300192；2 杭州医学院检验学院；3 天津医科大学检验学院

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一种非发酵的革兰氏阴性杆菌。PA是一种条件致病菌，广泛分布于自然界和人体皮肤、黏膜、呼吸道、胃肠道等部位中［1］。免疫力低下或不当介入性操作后PA可引起皮肤、呼吸道、泌尿道等系统感染，严重时可导致菌血症、心内膜炎等［2］，是院内感染的主要病原菌之一［3］。抗生素的广泛使用导致PA耐药株的出现，目前PA耐药率位居革兰氏阴性杆菌首位。PA已成为医院内获得性感染中最常见的多重耐药条件致病菌［4］。因此，要研究新抗菌方法来预防和治疗泛耐药PA导致的感染，是目前的研究热点。噬菌体（Bacteriophage）又被称为细菌病毒，是一类以微生物（包括细菌、螺旋菌、放线菌或真菌等）为宿主的病毒，通过特异性的侵入细菌，利用菌体内部的功能结构，合成自身成份，完成复制繁殖［5］。噬菌体可分为裂解性噬菌体和溶原性噬菌体［6］。其中裂解性噬菌体在感染宿主菌后可立即启动自身基因表达，通过基因表达产物降解宿主DNA，终止宿主基因表达，夺取宿主DNA复制亚细胞功能结构，大量合成噬菌体核酸并表达噬菌体结构蛋白，在宿主菌菌体内组装产生下一代噬菌体，当宿主菌内噬菌体积累到一定水平，可促进噬菌体穿孔素表达，穿孔素导致宿主菌内膜形成孔洞，同时噬菌体释放的裂解酶（endolysin）可分解细菌细胞壁，最终导致细菌裂解死亡［7］。裂解性噬菌体能够特异性地裂解细菌，对正常菌群和人体细胞不构成影响，且作用机制抗生素不同［8］。但使用噬菌体治疗细菌感染可能存在一些不足，如噬菌体裂解细菌导致机体免疫反应、某些噬菌体携带的毒素基因引起机体毒素反应、噬菌体自由增殖及噬菌体应用剂量的把握等问题［9］。噬菌体还存在抗菌谱，对同种细菌不同菌株的抗菌效果也存在一定不同［10］。对噬菌体裂解酶进行修饰，可能解决噬菌体毒素反应、剂量控制、抗原性等不足，为细菌感染的治疗提供了新思路，可能成为治疗细菌感染的新方法。目前国内外关于噬菌体裂解酶用于拮抗细菌的研究报道并不多见，有关泛耐药PA菌株噬菌体裂解酶的相关研究报道更少见。2021年1月-2022年10月，我们筛选泛耐药PA菌株广谱噬菌体，采用生物信息学方法预测泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶基因序列，进一步验证泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂裂解酶的抗菌活性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 MALDI-TOF-MS质谱仪靶版、CHCA基质液及ATS-335药敏卡均购自法国梅里埃公司），CaCl（2天津市北辰方正试剂厂）、LB培养基（北京索莱宝公司）、一次性滤器（美国默克密理博公司）、溴化乙锭（美国赛默飞公司）、PCR反应试剂盒及DL15000 DNA marker（大连宝生物工程公司），琼脂糖凝胶、DNA凝胶纯化试剂盒、基因组提取试剂盒及质粒提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司），限制性内切酶、T4连接酶及卡那霉素（大连宝生物工程公司），Ni2+亲和层析柱（美国GE公司）、PCR扩增引物、PCR扩增产物测序金唯智生物科技有限公司完成、电镜图片由杭州医学院合作单位完成。MALDI-TOF-MS质谱仪、自动比浊仪及VITIK2 compact全自动微生物分析仪均购自法国梅里埃公司，CO2培养箱（美国Sheldon公司）、-80 ℃低温冰箱（青岛海尔公司）、电泳仪（北京六一电泳仪厂）、自动凝胶成像仪及电转化仪（美国伯乐公司）、PCR仪（美国ABI公司）。

1.2 泛耐药PA菌株广谱噬菌体的筛选 ①泛耐药PA菌株的筛选（细菌药物敏感实验）：收集2016-2020年我院临床分离保存的PA菌株237株，均经MALDI-TOF-MS质谱仪鉴定后保留。采用药敏试验，用比浊仪配制0.5麦氏浓度PA悬液，转移至ATS-335药敏测试卡，启动VITIK2 compact全自动微生物分析仪观察PA菌株对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类常用抗生素的耐药性。最终筛选得到84株泛耐药PA菌株。②泛耐药PA菌株噬菌体的筛选（噬菌斑测定法）：采集天津市第一中心医院污水处理站尚未消毒的污水样本（噬菌体作为细菌病毒在污水中普遍存在［11］），0.1 g/L浓度加入CaCl2，10 000 g/min离心10 min除去固体杂质，收集上清，重复3次。取300 mL污水滤液，加入10株0.3 mL的泛耐药PA菌株悬液，混匀后室温静置60 min，摇床180 r/min，37 ℃过夜培养。将混悬液加入47 ℃融化的0.7%琼脂LB培养基2 mL，混匀后于固体LB平板铺平，37 ℃过夜培养，培养24 h后观察各培养基噬菌斑出现情况。有噬斑的培养基为存在泛耐药PA菌株噬菌体的培养基，继续培养增殖、纯化后获得泛耐药PA噬菌体9株，噬菌体大小均一，噬菌斑明显。③取9支EP管分别加入1麦氏浓度泛耐药PA菌株悬液0.3 mL+0.3 mL的PA噬菌体原液，混匀后培养24 h后观察噬菌斑出现情况。选取90%以上泛耐药PA菌株均出现噬菌斑的噬菌体为泛耐药PA菌株广谱噬菌体。

1.4 泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶基因的获取、序列确认

1.4.1 泛耐药PA菌株广谱噬菌体基因的获取与测序 采用Proteinase K裂解法获取泛耐药PA菌株广谱噬菌体基因，取泛耐药PA菌株广谱噬菌体，加入终浓度为 5 μg/mL 的 DNaseI及 1 μg/mL 的RNaseA，37 ℃温育 1 h，降解宿主菌的 DNA和RNA。加入固体PEG8000至10%（w/v）冰浴1 h。4 ℃ 12 000 g/min 离心10 min后弃上清。采用基因组提取试剂盒提取泛耐药PA菌株广谱噬菌体基因序列，由金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.4.2 泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶基因序列的确定 利用数据库ORF finder和BLAST预测泛耐药PA菌株广谱噬菌体基因开放阅读框，使用RNAmmer和tRNAsan-SE软件确定泛耐药PA菌株广谱噬菌体的rRNA、tRN的基因序列，用NCBI数据库中的BLASTN和BLASTP在线进行对比分析后，筛选得到泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶。

1.5 泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶的获取 、抗菌活性观察

1.5.1 泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶获取 采用Primer premier5.0软件根据泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶基因序列设计对应的引物进行PCR扩增。lysEPA19上游引物为CCGGAATTCATGACTGCYGATCAGG（529 bp），下 游 引 物 为 ATCAAGCTTTCATTGGTCACCACCC（529 bp）。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，终延伸 5 min，共40个循环。运用限制性内切酶酶切目的片段LysEPA19和质粒pET28a，T4连接酶连接目的片段和质粒，构建pET28a-LysEPA19重组质粒，对重组质粒进行测序以确定含有泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶基因序列，用重组质粒转染大肠杆菌BL21，用含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基培养，37 ℃ 培养至对数生长期，然后离心收集菌体，冰浴超声波破碎，4 ℃低温离心后取上清，用Ni-NTA亲和层析纯化，收集洗脱液，用SDS-PAGE电泳结果比对获得蛋白分子质量与泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶。

1.5.2 泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶的抗菌活性观察 取复苏传代的泛耐药PA菌株菌液，将其均匀涂抹至2个培养基，在培养基中分别滴加5、10 μL的泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶，37 ℃ 培养24 h后观察培养基上噬菌斑情况，如出现噬菌斑且越大说明抗菌效果越好。

2 结果

筛选得到泛耐药PA菌株广谱噬菌体EPA19。提取泛耐药PA菌株广谱噬菌体EPA19基因组。

对EPA19进行全基因组测序后预测开放阅读框90个，最终比对发现噬菌体EPA19裂解酶所在位置（ORF54），并将其命名为Lys EPA19。成功纯化得到Lys EPA19蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示Lys EPA19蛋白分子质量（27 kd）与目的蛋白相符。

培养泛24 h时加入5、10 μL的Lys EPA19培养基中均可见噬菌斑，且滴加10 μL的Lys EPA19培养基的噬菌斑大（见图1），5 μL LysEPA19噬菌斑为11～13 mm，10 μL的 LysEPA19噬菌斑为23～27mm。

图4 泛耐药PA菌株加入Lys EPA19培养后噬菌斑生长情况

3 讨论

PA具有易定植、易变异及复杂的耐药机制，重症患者感染PA后预后较差［12］。 鉴于PA感染的普遍性和严重程度，美国感染病学会已将其列为临床六大最危险致病菌之一［13］。全国细菌耐药监测数据［4］显示，泛耐药PA菌株逐年增多。本研究中泛耐药PA菌株的检出率为35.4%，与以往研究报道类似。因此噬菌体及其裂解酶的治疗PA感染是目前的研究热点。

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，其侵入细菌细胞内并产生酶破坏细胞壁从而裂解细菌。溶原性噬菌体和裂解性噬菌体［10］。前者是感染细菌后不增殖、不裂解细菌，而是将其核酸整合到细菌核酸上一起复制传代；后者是在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体并控制编码裂解酶最终使细菌裂解，也称毒性噬菌体。它产生的裂解酶主要作用于水解细菌细胞壁上的聚糖骨架［14-15］。多数噬菌体裂解酶都具有“双结构域结构”的特点，即N-端结构域具有催化活性，可以特异的切断肽聚糖（peptidoglycan，PG）的化学键，也称催化域 （catalytic domain）［16］。催化域中含有5种主要类型的酶活性：N-乙酰胞壁酶、转糖苷酶、内-b-N-乙酰氨基葡糖苷酶、内肽酶或者N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。催化结构域主要作用于细胞壁上的聚糖骨架或者多肽链之间的酰胺键［17］，还有少部分作用于肽聚糖比如分支杆菌噬菌体裂解酶［6］。所以作为抗菌手段之一的噬菌体裂解酶的研究对临床有重要价值而且还需要继续深入的探讨。

裂解酶作为极具潜力的抗生素替代物，它的高效、宽谱的裂解活性以及对理化因素的稳定性是实际应用的前提和基础［8］。本研究以分离的耐药PA广谱噬菌体为材料，提取其基因组进行测序和分析。将噬菌体编码的裂解酶通过克隆表达并诱导纯化得到重组蛋白，本研究还测定了裂解酶lysEPA19的活性，结果发现其对泛耐药铜绿假单胞菌有较好的裂解效果，为其未来应用提供了许多可能性，也同时为后续寻找新型噬菌体裂解酶以及探索裂解酶的机制奠定一定的理论基础。

目前针对感染细菌注射裂解酶已有一些方面的研究，有几种类型的注射已被证明其在动物模型中有效［18-21］。 ENTENZA等关注静脉内注射裂解酶的研究动物实验取得了一定效果。ADEL ABOUHMAD等［20］将T4裂解酶与纤维素融合模块用于将裂解酶固定在纤维素纱布材料上，该伤口敷料具有抗革兰阳性菌的活性，同时进一步增强了敷料抗血管生成作用和保质期。SCHUCH等［21］测试的金黄色葡萄球菌菌株（包括MRSA分离株） 噬菌体裂解酶抗菌活性，其结果发现裂解酶能明显提高患葡萄球菌性菌血症小鼠的存活率。BLAS BLAZQUEZ则利用链球菌噬菌体裂解酶有效控制肺炎链球菌的生长［22］。除了针对革兰氏阳性菌以外， LOOD等［23-24］学者对革兰氏阴性菌裂解酶也取得了一些进展，尤其是在耐药鲍曼不动菌裂解酶的研究进展明显。我国学者［25-26］均成功筛选出PA噬菌体裂解酶，并进一步验证其有效性。

本研究基于国内外对噬菌体裂解酶的研究，展开针对泛耐药PA菌株噬菌体裂解酶抗菌的尝试，成功筛选并表达出泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶lysEPA19，并完成其活性验证，达到预期效果。但本实验中也存在不足，第一，未做动物实验验证泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶蛋白lysEPA19活性，第二，未对lysEPA19蛋白进行加工修饰，探讨其成为治疗药物的可能性。天然裂解酶都为窄谱裂解酶，在实际实验过程中我们已经筛选出相对广谱的裂解酶，但若继续扩宽抗菌谱则需在蛋白层面对裂解酶进行修饰，以扩宽裂菌谱和降低不良反应，并且裂解酶lysEPA19与抗生素联用的协同抗菌性以及裂解酶的长时间杀菌活性也亟待进一步研究，以期达到临床使用的要求，为抗耐药铜绿假单胞菌治疗提供新的手段。

综上所述，成功筛选出泛耐药PA菌株广谱噬菌体EPA19及裂解酶Lys EPA19。Lys EPA19可有效抑制泛耐药PA菌株的生长。