β-葡萄糖苷酶对甜菊糖苷的水解作用条件

童红梅，宋巧*，张敏，郭敏，何丹

甘肃医学院（平凉 744000）

甜叶菊（Steviarebaudiana）原产南美洲的菊科（Asteraceae）甜菊属（Stevia）多年生草本植物，因其叶片含有高甜度低热量的甜菊糖苷（steviolglycosides）而闻名[1]，甜菊糖苷是甜叶菊体内的一种次生代谢产物，其甜度高达蔗糖的250～450倍，热量却低至蔗糖的1/300，作为天然低热量甜味剂被誉为“世界第三糖源”[2]，广泛应用于食品、饮料、医药、化工等领域。并具有预防和治疗肥胖症、糖尿病、高血压、抗氧化、抗菌抗癌和增强免疫力等药用价值[3-5]。

β-葡萄糖苷酶又称β-D-葡萄糖苷水解酶，可有效调节甜菊糖苷的合成与分解、糖基化与去糖基化的动态平衡，促进甜菊糖苷的水解[6-7]，这在甜菊糖苷提取研究中尚未见相关报道。为此，试验通过添加β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷，对β-葡萄糖苷酶的生物学特性进行研究，以期明确β-葡萄糖苷酶对甜菊糖苷产量、品质指标影响的内在作用机制，为甜菊糖苷成品高品质奠定理论与试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验以甘肃省平凉产甜叶菊品种“普6”为试验材料，于2021年9月甜菊旺盛生长期采集植株中上部的新鲜茎秆、叶片，称重10.000 g分装，液氮速冻后于冰箱-80 ℃保存，由平凉市农科院专家鉴别，冷藏于0 ℃备用。

1.2 试验仪器

岛津LC-16型液相色谱仪，色谱检测工作站、二元阵列高压电子梯度色谱泵、二极管阵列色谱检测[岛津仪器（苏州）有限公司]；鼓风干燥箱（山东博科科学仪器公司）；SY-500型数控超声波清洗仪（250 W、40 kHz，合肥恒泰超声波设备有限公司）；FA2004型分析天平（济南鑫宇鑫医疗设备有限公司）；SHB-III型循环水式多用真空泵（河南省艾瑞德仪器设备有限公司）；JY-33型手持糖度计（西安测维光电）。

1.3 试验试剂

75%乙醇（分析纯，无锡源之泉化工产品有限公司）；乙腈（色谱纯，山东瑞港化工有限公司）；甲醇（色谱纯，东莞市南箭精细化工有限公司）；磷酸（分析纯，山东振华工业股份有限公司）；莱鲍迪苷A（生产批号21041011，规格1 g/支，纯度≥98%）；斯替夫苷（生产批号21034008，规格1 g/支，纯度≥98%）；甜菊苷（生产批号21082603，500 mg/支，纯度≥98%）；超纯水。

1.4 试验方法

1.4.1β-葡萄糖苷酶活性测定与计算

试管中取600 μL酶液、200 μL pH 7.0的磷酸缓冲液和200 μL 10 mmol/L的对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside，pNPG），混匀后置于37 ℃恒温水浴锅内反应1 h。反应结束后，加入2 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应。反应液以5 000 r/min离心1 min后，取上清液于410 nm波长进行比色，以加热失活的酶液同样处理为空白对照[8]。

1.4.2β-葡萄糖苷酶酶活力

β-葡萄糖苷酶活力国际单位定义为以pNPG为底物，每分钟释放出1 μmol对硝基苯酚（pNP）所需要的酶量。β-葡萄糖苷酶能水解pNPG中的糖苷键生成pNP，pNP在碱性溶液中呈现黄色，在410 nm波长下有最高吸收峰，故用分光光度法测定波长410 nm处的吸光度，绘制标准曲线，根据标准曲线计算β-葡萄糖苷酶的活力[9]。

1.4.2.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制

准确称量pNP 139.0 mg，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL。分别吸取该溶液1，2，3，4，5和6 mL至100 mL容量瓶中，用1 mol/L Na2CO3溶液定容并将其混匀，使pNP浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 μmol/L。以蒸馏水为空白对照，在410 nm波长处测定吸光度，吸光度为纵坐标，pNP的浓度为横坐标，绘制pNP标准曲线。

1.4.2.2 酶活性计算

酶活性=Y×V2×V/K×V1×M×T（1）式中：酶活性单位为U/g；Y为酶促反应的吸光度；V2为总反应液量，mL；V为酶液的提取总量，mL；K为对硝基苯酚标准曲线斜率；V1为反应体系中酶液量，mL；M为试样质量，g；T为反应时间，min。

1.4.3β-葡萄糖苷酶作用条件研究

1.4.3.1β-葡萄糖苷酶最适酶浓度确定

天平精确称取10 g干燥的甜菊茎秆、叶片，研成粉末，以1∶50（g/mL）比例加入75%乙醇，44.7 Hz、60 ℃超声提取60 min，加入500，600，700，800和900 U的β-葡萄糖苷酶；重复3次，将样本置于40 ℃水浴锅中，反应2 h后，按10 000 r/min 30 s离心取上清液并经0.45 μm微孔滤膜过滤备用。测定可溶性固形物、莱孢迪苷、斯替夫苷 的含量。

1.4.3.2β-葡萄糖苷酶最适温度确定

天平精确称取10 g干燥的甜菊茎秆、叶片，研成粉末，以1∶50（g/mL）比例加入75%乙醇，44.7 Hz、60 ℃超声提取，加入500 Uβ-葡萄糖苷酶；重复3次，将样本置于30，40，50，60 和70 ℃水浴锅中，2 h后按10 000 r/min，30 s离心取上清液并经0.45 μm微孔滤膜过滤备用。测定可溶性固形物、莱孢迪苷、斯替夫苷 的含量。

1.4.3.3β-葡萄糖苷酶最适pH确定

天平精确称取10 g干燥的甜菊茎秆、叶片，研成粉末，以1∶50（g/mL）比例加入75%乙醇，按44.7 Hz、60 ℃超声提取60 min，加入500 Uβ-葡萄糖苷酶；重复3次；滴加pH 5.0，6.8，7.0，8.0和9.0的磷酸盐溶液20滴，将样本置于40 ℃水浴锅中，反应2 h后，按10 000 r/min，30 s离心取上清液并经0.45 μm微孔滤膜过滤备用。测定可溶性固形物、莱孢迪苷、斯替夫苷的含量。

1.4.4 HPLC法测定甜菊糖苷含量

1.4.4.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～20 min，10%～90%，20～30 min，90%～100%），流速0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

1.4.4.2 标准品溶液制备

甜菊苷含量（质量分数，以干基计）≥99.0%。莱鲍迪苷A与斯替夫苷（St）标准品：质量分数，以干基计≥99.0%。将甜菊糖苷标准品置于105 ℃干燥箱中烘2 h，精密称取5 mg，溶液溶解并定容至10 mL，摇匀置于棕色瓶中。即配成质量浓度0.5 mg/mL的标准品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。吸取10 μL标液进样，并记录。

1.4.4.3 甜菊糖苷供试样品溶液的制备

按照1.4.3方法制备样品。

1.4.4.4 结果计算取上述供试样品溶液连续进样3次，进样量10 μL，记录峰面积，计算甜菊苷、莱孢迪苷、斯替夫苷 的含量。

1.4.5 数据处理

试验结果采用SPSS 22.0和Excel 2010进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制

按照1.4.2.1的方法绘制对硝基苯酚标准曲线，结果如图1所示。横轴X为对硝基苯酚的浓度（μmol/L），纵轴Y为吸光度，得到对硝基苯酚标准曲线的回归方程。后续试验将根据该标准曲线通过吸光度计算酶活力。

图1 对硝基苯酚标准曲线

2.2 β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用条件研究

2.2.1β-葡萄糖苷酶最适酶浓度确定

取甜菊糖苷茎秆、叶片超声提取液10 mL，添加β-葡萄糖苷酶量500，600，700，800和900 U/g，反应温度为40 ℃、反应时间为2 h，测定可溶性固形物含量，结果如表1所示。随着β-葡萄糖苷酶量的增加，茎秆与叶片中可溶性固形物含量呈现增加趋势，β-葡萄糖苷酶量700 U/g时茎秆中可溶性固形物含量最高，β-葡萄糖苷酶量600 U/g时叶片中可溶性固形物含量最高，随着酶浓度继续增加，茎秆中可溶性固形物含量增幅变慢；考虑到成本建议β-葡萄糖苷酶最适酶浓度确定为600 U/g适宜。

表1 不同酶浓度对β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影响（±S）

表1 不同酶浓度对β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影响（±S）

β-葡糖糖苷酶酶浓度/(U·g-1)叶片可溶性固形/%500 8.01 8.89 600 12.33 12.87 700 12.77 11.37 800 12.10 11.51 900 12.33 11.62茎秆可溶性固形物/%

2.2.2β-葡萄糖苷酶最适温度确定

取10 mL甜菊糖苷茎秆、叶片超声提取液，添加β-葡萄糖苷酶量600 U/g，反应温度分别为30，40，50，60和70 ℃，反应时间为2 h，测定可溶性固形物的含量，结果如表2所示。40 ℃时茎秆、叶片中的可溶性固形物含量最高，说明β-葡萄糖苷酶40 ℃时酶活性最高，水解甜叶菊茎秆、叶片中甜菊糖苷物质效果最好，随着温度升高酶活性受到抑制，水解作用变弱。由此可见β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的最适温度为40 ℃。

表2 不同温度对β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影响（±S）

表2 不同温度对β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影响（±S）

反应温度/℃ 茎秆可溶性固形物/% 叶片可溶性固形/%30 10.01 10.89 40 12.27 13.57 50 8.53 9.41 60 8.31 7.41 70 7.24 7.22

2.2.3β-葡萄糖苷酶最适pH确定

取甜菊糖苷茎秆、叶片超声水提取液10 mL，添加β-葡萄糖苷酶量600 U/g，反应温度40 ℃、反应时间2 h，pH分别为5.0，6.8，7.0，8.0和9.0，进行水解反应，测定可溶性固形物含量，结果如表3所示。pH 7.0时，该酶活性最强，茎秆叶片中可溶性固形物含量最高，偏酸偏碱都不利于甜菊糖苷水解。

表3 不同pH对β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影响（±S）

表3 不同pH对β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影响（±S）

pH 茎秆可溶性固形物/% 叶片可溶性固形物/%5.0 6.80 7.42 6.8 9.75 10.44 7.0 9.87 10.89 8.0 5.54 5.21 9.0 5.11 5.14

2.2.4 HPLC法测定甜菊糖苷含量

取10 mL甜菊糖苷茎秆、叶片超声提取液，在β-葡萄糖苷酶添加量600 U/g、反应温度40 ℃、反应时间2 h、pH 7.0条件下制备反应液，未添加β-葡萄糖苷酶的做对照（CK），HPLC条件为C18反相色谱柱（250.0 mm×4.6 mm），流动相为乙腈-磷酸钠缓冲液（30∶70，体积比），梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温40 ℃，测定波长210 nm，进样量10 μL，计算峰面积。结果如表4所示。

表4 HPLC法测定β-葡萄糖苷酶量水解甜菊糖苷含量单位：mg/g

甜叶菊“普六”品种的茎秆中甜菊糖苷含量为0.167 mg/g，莱鲍迪苷A含量为0.125 mg/g，斯替夫苷含量为0.022 mg/g；叶片中的甜菊糖苷含量为0.184 mg/g，莱鲍迪苷A含量为0.153 mg/g，斯替夫苷 含量为0.035 mg/g，叶片甜菊糖苷含量高于茎秆；与对照相比，甜叶菊茎秆中甜菊糖苷含量提高28.7%，莱孢迪苷A含量提高23.7%，斯替夫苷 含量提高15.8%；叶片中甜菊糖苷含量提高19.9%，莱孢迪苷A含量提高25.7%，斯替夫苷含量提高21.9%；由此可见，β-葡萄糖苷酶可有效水解甜叶菊茎秆与叶片中的糖苷类物质，可以提高甜菊糖苷得率。

3 结论

β-葡萄糖苷酶在自然界中广泛存在，其生物学功能多种多样[10]，可以是植物醇系香气产生的一种关键酶，在橡胶[12]、葡萄[13]、茶树等植物中已有大量研究报道，同时该酶在人参皂苷、大豆异黄酮苷等萜类糖苷降解中的关键作用也有研究[14-15]。甜菊糖苷是以甜菊醇为苷元的四环二萜类糖苷，β-葡萄糖苷酶理应对甜菊糖苷的分解转化起作用[16]。

以甜叶菊茎秆和叶片为试验材料，结果表明pH 7.0、β-葡萄糖苷酶添加量600 U/g、40 ℃条件下水解、超声（60 ℃、44.7 Hz、2 h）乙醇提取的甜菊糖苷、甜叶菊茎秆中甜菊糖苷含量为0.167 mg/g，莱鲍迪苷A含量为0.125 mg/g，斯替夫苷 含量为0.022 mg/g；叶片中甜菊糖苷含量为0.184 mg/g，莱鲍迪苷A含量为0.153 mg/g，斯替夫苷含量为0.035 mg/g，叶片甜菊糖苷含量高于茎秆。与未经β-葡萄糖苷酶处理对照相比，甜叶菊茎秆中甜菊糖苷含量提高28.7%，莱孢迪苷A含量提高23.7%，斯替夫苷含量提高15.8%。叶片中甜菊糖苷含量提高19.9%，莱孢迪苷A含量提高25.9%，斯替夫苷含量提高21.9%。由此可见，β-葡萄糖苷酶可有效水解甜叶菊茎秆与叶片中的糖苷类物质，提高甜菊糖苷得率，茎秆中的甜菊糖苷也得以被利用。