自发性2型糖尿病KKAy小鼠心脏结构和功能改变实验研究

温雅璐，吴宏辉，黄举凯，王 姗，张 力，官 臻，王建华，杨晓晖

(1. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078；3. 首都儿科研究所转化医学研究室，北京 100020)

近年来，糖尿病已成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题之一。我国作为世界第一糖尿病大国，成年人的糖尿病患病率高达11.2%[1]，而2型糖尿病约占所有糖尿病患者的90%～95%[2]。各种临床试验表明，在射血分数保留的心力衰竭患者中，糖尿病的患病率可达45%[3]。因此，糖尿病可显著增加患者发生不良心血管事件和心力衰竭的风险。糖尿病心肌病作为2型糖尿病最严重的并发症之一，其临床特征主要为舒张功能障碍和心肌硬度增加导致的心力衰竭[4-5]。然而，目前尚无专门针对糖尿病心肌病的治疗方法，因此亟须建立稳定可靠、重复性高且符合人类糖尿病心肌病的动物模型以探讨其发病机制并寻求治疗药物。目前应用较为广泛的糖尿病心肌病模型为诱发性动物模型，但该模型成模率较不稳定且需要对注射方法及剂量进行摸索，自发性2型糖尿病KKAy小鼠因其具有先天性胰岛素抵抗的特性，已作为肥胖和轻度高血糖的动物模型广泛应用于对人类2型糖尿病发病机制的探究[6]，但其在糖尿病心肌病的研究中应用尚少。因此，本研究拟通过对自发性2型糖尿病KKAy小鼠心功能检测和病理学观察等，评估其是否为糖尿病心肌病模型，并探究其在糖尿病心肌病研究方面的应用价值，为后续药效实验的开展提供依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性12周龄KKAy小鼠24只，体重(36.90±1.91)g；SPF级雄性12周龄C57BL/6J小鼠24只，体重(27.71±1.03)g。小鼠均购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008]，在首都儿科研究所SPF级实验动物房[SYXK(京)2017-0030]常规饲养，温度20～24 ℃，湿度40%～60%，每12 h交替照明。KKAy小鼠给予高脂饮食，C57BL/6J小鼠给予普通饲料，饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均自由进食饮水。该研究由首都儿科研究所实验动物伦理委员会批准(DWLL2021013)，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2实验试剂 伊红染液(北京Solarbio公司，货号：G1100)；苏木素染液(北京Solarbio公司，货号：G1140)；改良Masson三色染色试剂盒(北京Solarbio公司，货号：G1346)；载玻片(江苏世泰CITOTEST公司，货号：188105W)；盖玻片(江苏世泰CITOTEST公司，货号：10212424C)；中性树胶(北京Solarbio公司，货号：G8590)。

1.3主要仪器 罗氏活力血糖仪及其配套试纸(上海罗氏制药有限公司)；全封闭式组织脱水机(德国Leica公司)；全自动组织包埋机(德国Leica公司)；轮转式切片机(德国Leica公司)；高分辨率小动物彩色多普勒超声成像系统(美国Visual Sonics公司)。

1.4实验方法 12周龄KKAy小鼠适应性喂养2周后，禁食12 h，尾静脉取血，测定空腹血糖，选取空腹血糖≥13.9 mmol/L小鼠为糖尿病模型成立小鼠，作为模型组；24只同周龄的C57BL/6J小鼠作为对照组。实验过程中观察小鼠的活动状态、毛色、精神状态、饮食、二便情况，每周测体重。2组小鼠于14，18，22，26周龄按随机原则各取6只，行超声心动图检查，获取小鼠经胸廓二维、M模式超声心动图和脉冲波多普勒谱成像，记录小鼠左心室射血分数(LVEF)、舒张期左室前壁厚度(LVAWd)、舒张期左室后壁厚度(LVPWd)、二尖瓣口血流多普勒E/A、二尖瓣环组织多普勒e’/a’和E/e’；处死前禁食12 h，尾静脉取血，用血糖仪测定小鼠空腹血糖水平；麻醉小鼠，开胸取出心脏，冰盐水清洗后称重，切取心脏左室部分心肌放入4%多聚甲醛组织固定液固定、脱水、石蜡包埋、制片，行HE染色、Masson染色，在光镜下观察心肌组织形态学改变及心肌胶原纤维染色情况。

1.5统计学方法 使用SPSS 21.0软件统计数据，分析数据是否满足正态分布，不满足正态分布的计量数据组间比较采用秩和检验，满足正态分布且方差齐时组间比较采用独立样本t检验，不齐时采用t’检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组小鼠14，18，22，26周龄体重及空腹血糖变化比较 14，18，22，26周龄的模型组小鼠体重、空腹血糖水平均明显高于同期对照组(P均<0.05)，且均随周龄增长逐渐增高。见表1。

表1 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠14，18，22，26周龄体重及空腹血糖比较

2.22组小鼠14，18，22，26周龄心脏结构及功能学指标比较 对照组24只、模型组22只(在22周和26周超声检测过程中各死亡1只)小鼠完成心功能检测。不同周龄模型组小鼠的LVAWd和LVPWd均明显高于同期对照组(P均<0.05)，且随周龄增长逐渐增加。不同周龄模型组小鼠的二尖瓣口血流多普勒E/A、二尖瓣环组织多普勒e’/a’均明显低于同期对照组(P均<0.05)，且随周龄增长逐渐降低；而E/e’均明显高于同期对照组(P均<0.05)，且随周龄增长逐渐增高；2组小鼠的LVEF比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，均在正常范围内。见表2。

2.32组心脏组织HE染色病理形态学变化 光镜下观察，各周龄对照组小鼠的心肌细胞排列整齐、致密，结构清晰，细胞核呈卵圆形；模型组小鼠14周龄时出现心肌细胞排列紊乱，细胞肿胀，心肌细胞肥大、细胞间隙增大、空泡样变，可见炎症细胞浸润和成纤维细胞浸润等病理变化，且随周龄增长病理变化逐渐加重。见图1。

图1 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠心脏组织HE染色表现

2.42组心脏组织Masson染色病理变化 光镜下观察，模型组小鼠各周龄均可在心肌间质及血管周围观察到胶原纤维(呈蓝色)，且胶原纤维面积均明显大于对照组(P均<0.05)，同时可见胶原纤维将心肌分隔成岛状。见图2及图3。

图2 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠心脏组织Masson染色表现(×400)

图3 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠心肌间质及血管周围胶原纤维面积

3 讨 论

随着社会经济的发展和饮食结构的改变，全球糖尿病人群的数量逐年增长，糖尿病心肌病的发病率也呈逐渐升高的趋势。糖尿病心肌病是发生于糖尿病中的心肌功能失调，其独立于已知病因如高血压、心脏瓣膜疾病、冠心病及其他心脏病因素所导致的心脏结构和功能异常。其发病机制尚不明确，主要与肾素-血管紧张素-醛固酮系统紊乱、炎症反应、氧化应激、脂代谢紊乱和多元醇通路激活等因素有关[7]，因此，亟须探索稳定可靠的动物模型进一步探讨糖尿病心肌病的发病机制并评价药物的有效性及安全性。

动物模型与人类疾病的相似程度是判断模型价值的重要标准，目前用于研究糖尿病心肌病的动物模型主要包括诱发性糖尿病心肌病模型和自发性糖尿病心肌病模型。诱发性糖尿病心肌病模型常采用单纯高脂或高糖饮食[8-9]或高脂饲料喂养结合小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素诱发[10-11]，然而该类模型存在造模时间较长、操作流程较为繁琐等问题，且通过人为限定方式诱发与疾病的自然进程存在一定差异，实验发现小鼠模型虽然产生了类似2型糖尿病的症状，但并未出现肥胖[12]。此外，大多数实验在研究过程中仅以血糖作为前期筛选模型的方式，增加了此类模型的不稳定性。

KKAy小鼠是在KK小鼠的基础上转入突变基因(Ay)的2型糖尿病动物模型，可在遗传和环境因素的共同作用下出现高血糖、高胰岛素血症、脂质代谢紊乱和肥胖等2型糖尿病典型表现[13]，与人类2型糖尿病的病因非常相似。C57BL/6J小鼠呈黑色，与KKAy小鼠具有基因同源性，故本研究选择该类小鼠作为正常对照。本研究通过连续监测14，18，22，26周龄小鼠体重及空腹血糖发现，所有KKAy小鼠的空腹血糖均持续高于13.9 mmol/L，且体重及空腹血糖均显著高于对照组，表明经过高脂饲料喂养后，KKAy小鼠的体重及血糖会维持较高水平。为进一步观察KKAy小鼠是否可作为糖尿病心肌病模型，本研究对其进行心脏功能学和心脏病理学观察。既往研究发现，在16，18，22，24周龄KKAy小鼠心肌间质均可观察到大量胶原纤维的沉积，而在C57BL/6J小鼠心肌组织中未观察到相关病理表现[14-17]。此外，有研究对KKAy小鼠心肌组织行电镜检查，发现其在16周龄时已出现闰盘附近肌丝紊乱、Z带消失和脂质样空泡聚集等表现，且病变程度随时间不断加重直至40周龄；同时，20周龄KKAy小鼠心脏组织在电镜下存在心肌细胞胞浆疏松、内质网及细胞核肿胀、线粒体肿胀、嵴消失等特点，超微结构表明KKAy小鼠心肌组织存在一定的病理改变[18-19]。本研究动态观察发现，14周龄KKAy小鼠的心肌细胞已出现排列紊乱、细胞肿胀、心肌细胞肥大、细胞间隙增大、空泡样变等表现，其间可见炎症细胞浸润，同时除心肌间质外，心肌组织血管周围亦有大量胶原纤维沉积，且随周龄增长逐渐增加，这些均与既往研究结果一致，证实KKAy小鼠心脏组织存在心肌纤维化的病理特征。超声检查心脏结构发现，14周龄KKAy小鼠已出现心肌肥厚的特征，左心室心肌参数较对照组均显著增加，且随时间延长室壁厚度稳定增加，表明长期慢性损伤及负荷过重可导致心肌细胞肥大，进而引起左心室室壁厚度增加。

本实验选择小鼠二尖瓣口血流多普勒E/A、二尖瓣环组织多普勒e’/a’及E/e’评估心脏舒张功能。心脏舒张功能为心肌主动松弛和心室被动充盈的能力，其中二尖瓣口血流多普勒E/A主要依据瓣口左房室之间的压力阶差反映左室舒张功能，E波为舒张早期二尖瓣血流速度，反映左心室的主动松弛功能，A波为舒张晚期二尖瓣血流速度，反映左心室被动扩张的功能[20]；二尖瓣环组织多普勒e’/a’则可直接反映整个舒张期左室壁心肌的运动情况，主要受左室机械运动的影响，较少受心脏前后负荷的影响，e'波为舒张早期充盈峰值速度，a’波为舒张晚期充盈峰值速度[21]；由于E/e’可反映左心室充盈压，且受到左心收缩功能影响较小，故可将其作为评估心室舒张功能的指标[22]。因此，作为了解心脏舒张功能的经典方法，本研究将三者结合使用以提高对心脏舒张功能评价的敏感性。既往研究发现，在16周龄KKAy小鼠中可观察到E/A显著小于C57BL/6J小鼠[14]，同时在其他2型糖尿病心肌病小鼠中可观察到其心脏功能学指标E/A和e’/a’均显著降低，而E/e’显著升高[23]。本研究中KKAy小鼠E/A、e’/a’自14周龄起均显著低于对照组，且随时间变化比值逐渐减小，而E/e’显著高于对照组，且随时间变化比值逐渐增加，与其他2型糖尿病心肌病小鼠心脏功能学指标结果一致，符合人类2型糖尿病心肌病的关键特征，表明KKAy小鼠在早期已出现心脏舒张功能降低，且随疾病进展逐渐加重，但2组小鼠的LVEF均在正常范围。目前研究发现众多患有2型糖尿病且伴有心血管疾病的患者存在心脏舒张功能障碍，然而在此类患者中未检测到心脏收缩功能障碍，且糖尿病心肌病随疾病进展最终可演变为射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)[24]。此外，与射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)相比，HFpEF为心力衰竭住院更常见的原因[25]。因此，亟须探索更符合糖尿病心肌病临床特征及发病特点的动物模型，而KKAy小鼠是较符合糖尿病心肌病特征的动物模型。

研究表明，持续血糖升高可诱导心肌细胞发生肥大、变性、坏死，同时出现心肌纤维化和心肌僵硬度增加，从而使得心脏结构发生重构，进一步导致耗氧量增加及心肌缺血，使得心脏在早期出现舒张功能障碍[26]。因此，糖尿病心肌病的结构改变特征主要包括左心室室壁厚度增加、心肌纤维化、心肌细胞脂肪沉积等；功能改变特征主要为左室射血分数保留的心脏舒张功能障碍[27]。本研究发现，KKAy小鼠自14周龄起，持续的高糖状态可加重心室重构及心肌纤维化，进一步引起心室舒张功能异常，其心功能改变与心脏结构及心肌病理变化基本吻合。因此，自发性2型糖尿病KKAy小鼠虽然成本及生存条件要求较高，但其造模稳定，死亡率低，且更为符合糖尿病心肌病疾病特征，可提高研究效率，节约经济成本和时间成本。

综上所述，KKAy小鼠在高脂饮食喂养后血糖持续升高，且心室室壁厚度稳定增加，并伴有持续性心肌纤维化及心脏舒张功能障碍等特征，更加符合糖尿病心肌病的发病特征，且与人类2型糖尿病心肌病临床特征及病程进展相符，证明它是较为稳定的糖尿病心肌病模型，但其具体发病机制还需再进一步验证。本结果为深入研究糖尿病心肌病发病机制提供了重要依据，也为后期治疗药物研究提供了有效的动物实验模型基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。