蓬子菜中香叶木苷对华法林在大鼠体内药动学和药效学影响的研究

崔明宇，隋 玥，胡启萌，朱凤梅，尹义凤，于 超，阎雪莹，苏 慧

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

华法林是目前临床上最为常用的口服香豆素类抗凝血药物，在肺栓塞、心脏金属瓣膜置换术后、房颤及下肢深静脉血栓等血栓性疾病的抗凝预防与治疗中占有重要地位[1]。由于华法林治疗窗较窄，其抗凝效果需要通过国际标准化比值(INR)进行监测，当INR值高于或低于正常范围，患者会出现出血或抗凝效果降低的不良反应[2]。此外，华法林通过CYP2C9、CYP1A2、CYP3A4代谢[3]，当与其他药物联合用药时，可能存在药物相互作用，进而导致抗凝效果发生明显变化。随着中西药在抗凝治疗中的联用，中药及天然药物与华法林的相互作用越来越引起重视。香叶木苷为从蓬子菜中分离得到的一种黄酮苷[4]，其在薄荷[5]、柠檬[6]、佛手[7]、豆类、橄榄叶[8]等多种植物与食物中均有分布。临床应用香叶木苷及相关制剂进行血栓性疾病的治疗，能促进下肢深静脉血栓形成后的静脉再通，减轻炎症反应，改善淋巴循环、毛细血管通透性和组织缺氧[9-10]，临床可与华法林联合治疗下肢深静脉血栓[11-12]，可提高溶栓有效率，改善下肢周径[13]。但也有临床报道，香叶木苷制剂与华法林联用可引起脑室内出血[14]。课题组前期研究发现，蓬子菜总黄酮对华法林在大鼠体内的药动学与药效学具有影响，提示临床应用应进行监测并调整剂量[15]，但尚未有香叶木苷与华法林联用的相互作用研究报道。有文献研究表明，香叶木苷可抑制人体CYP2C9[16-17]和CYP3A4[18]的活性，推测其与华法林联合应用时会对华法林的体内代谢过程产生影响，从而影响华法林抗凝疗效和用药安全。本研究考察了蓬子菜中黄酮类化合物香叶木苷对华法林在大鼠体内药动学和药效学的影响，旨在为临床香叶木苷与华法林的联合用药、个体化给药方案及联合应用机制的深入研究提供科学依据，同时也为香叶木苷、蓬子菜制剂及其他含香叶木苷的中草药与食物同华法林联合应用的有效性与安全性研究奠定基础。

1 实验材料与方法

1.1仪器 LC-2010A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；XW-80A型涡旋混合器(上海医用仪器厂)；SK8200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；LDZ4-2型自动平衡离心机(常州市国立试验设备研究所)；BT25S型分析天平(德国Sartorius公司)；ZGDCY-12S型氮吹仪(上海梓桂仪器有限公司)。

1.2药品与试剂 华法林钠片(上海信谊药厂有限公司，批号：18161201B，规格：2.5 mg/片)；香叶木苷(本实验室自提，纯度>98%)；华法林对照品(大连美仑生物技术有限公司，批号：J0206AS)；萘普生钠对照品(大连美仑生物技术有限公司，批号：J1010AS)；凝血酶原时间(PT)试剂(上海太阳生物技术有限公司，批号105446)；色谱甲纯(dikma公司)，其他试剂均为分析纯。

1.3实验动物 清洁级雄性SD大鼠24只，体重(200±20)g，购于青岛市实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(鲁)20200010。大鼠饲养于温度(24±2)℃、湿度(50±5)%、12 h光照、12 h黑暗循环的动物房。本研究严格遵守国家医学动物实验研究的相关规定，动物实验经黑龙江中医药大学伦理委员会批准。

1.4分组及给药 将24只雄性SD大鼠随机分为4组，每组6只。单剂量华法林组给予0.5%CMC-Na液灌胃，单剂量华法林+香叶木苷组给予香叶木苷药液80.00 mg/kg(按人临床常用剂量换算所得)灌胃，均每日1次，连续7 d；第8天，2组在上述干预基础上再分别给予华法林药液0.25 mg/kg(按人临床常用剂量换算所得)灌胃1次。华法林稳态组、华法林稳态+香叶木苷组每天给予华法林药液0.25 mg/kg灌胃，每日1次,连续8 d；第5天起，华法林稳态组同时给予0.5%CMC-Na液灌胃，华法林稳态+香叶木苷组同时给予香叶木苷药液80.00 mg/kg灌胃，均每日1次。

1.5药动学实验方法

1.5.1色谱条件 色谱柱：TopsilC18(250 mm×4.6 nm)；流动相∶甲醇-0.2%乙酸水(65∶35)；流速：1 mL/min；紫外检测波长：284 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

1.5.2标准溶液的配制 精密称取华法林对照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制质量浓度为1 mg/mL的华法林标准储备液。另精密称取萘普生钠对照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制质量浓度为1 mg/mL的萘普生钠标准储备液，进一步稀释得4 μg/mL的萘普生钠内标液。

1.5.3血浆样品的处理 精密吸取100 μL血浆置于离心管中，加入50 μL 4 μg/mL萘普生钠内标液，加入2 mL甲醇，涡旋混合均匀，3 500 r/min离心10 min。精密移取上层有机相1.5 mL，40 ℃氮气流下吹干，100 μL流动相复溶。以0.45 μm滤膜过滤，进样分析。

1.5.4方法学考察

1.5.4.1专属性考察 分别取空白血浆、空白血浆+华法林标准溶液+萘普生钠内标液及给药2 h后血浆样品+萘普生钠内标液，按“1.5.3”项下方法处理后，记录色谱图，结果见图1。华法林和萘普生钠的保留时间分别为13.9 min和12.3 min，供试品溶液和标准溶液的保留时间一致，峰形良好，分离度符合要求，专属性强。

A为空白血浆；B为空白血浆+华法林+萘普生钠；C为含药血浆+萘普生钠；1为华法林；2为萘普生钠图1 高效液相色谱图

1.5.4.2标准曲线的制备 精密吸取华法林标准储备液适量，分别配制成浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 μg/mL的华法林标准溶液。各取100 μL系列标准溶液，40 ℃氮气流下吹干，分别加入空白血浆100 μL。余下按“1.5.3”项下方法处理，记录色谱图。以华法林与萘普生钠峰面积比(y)为纵坐标，以质量浓度(x)为横坐标进行线性回归，求得标准曲线：y=0.310 2x+0.227 9(r=0.997 1)。线性范围为0.5～3.5 μg/mL，其定量下限为0.5 μg/mL。

1.5.4.3准确度与精密度试验 精密吸取华法林标准储备液适量，分别配制成浓度为1.0，2.0，3.0 μg/mL的华法林标准溶液各5份，分别吸取100 μL溶液，40 ℃氮气流下吹干，加入空白血浆100 μL。余下按“1.5.3”项下方法处理，于同一天内不同时间测定5次，连续3 d，记录色谱图，计算准确度、日内精密度、日间精密度。低、中、高浓度准确度RE分别为92.06%，98.87%，102.07%，日内精密度RSD分别为6.23%，2.69%，2.31%，日间精密度RSD分别为7.74%，2.98%，2.29%，符合生物样品测定要求。

1.5.4.4稳定性试验 精密吸取华法林标准储备液适量，分别配制成浓度为1.0，2.0，3.0 μg/mL的华法林标准溶液各5份，分别吸取100 μL溶液，40 ℃氮气流下吹干，加入空白血浆100 μL。余下按“1.5.3”项下方法处理，于室内放置24 h、-20 ℃保存15 d、3次冻融循环，记录色谱图，计算稳定性。低、中、高浓度室内放置24 h的RSD分别为3.44%，3.69%，3.69%，-20 ℃放置15 d的RSD分别为5.26%，2.31%，3.32%，3次冻融循环的RSD分别为7.69%，3.75%，2.79%，符合生物样品测定要求。

1.5.5血浆样品的采集与数据处理 单剂量华法林组、单剂量华法林+香叶木苷组灌胃华法林后开始计时，分别于第0.5，1，2，4，8，12，24，48，72，96，120，144 h采集眼内眦静脉血0.4 mL于肝素化离心管中，3 500 r/min离心10 min，分离血浆，于-20 ℃冰箱保存待测。华法林稳态组、华法林稳态+香叶木苷组灌胃华法林后开始计时，分别于第1，2，3，4，5，6，7，8 天采集眼内眦静脉血0.4 mL于肝素化离心管中，3 500 r/min离心10 min，分离血浆，于-20 ℃冰箱保存待测。各组均按“1.5.3”项下方法处理，记录华法林与内标物峰面积。应用DAS 2.0药动学软件，求算各组华法林的药动学参数，SPSS 25.0软件进行统计学分析。

1.6药效学实验方法

1.6.1血浆样品的采集 单剂量华法林组、单剂量华法林+香叶木苷组灌胃华法林后开始计时，分别于第0，1，2，4，8，12，24，36，48，72 h采集眼内眦静脉血0.4 mL于枸橼酸钠管中，3 500 r/min离心10 min，分离血浆，于-20 ℃冰箱保存待测。华法林稳态组、华法林稳态+香叶木苷组灌胃华法林后开始计时，分别于第1，2，3，4，5，6，7，8天采集眼内眦静脉血0.4 mL于枸橼酸钠管中，3 500 r/min离心10 min，分离血浆，于-20 ℃冰箱保存待测。

1.6.2PT的测定 冷冻的血浆样品解冻后，取血浆样品100 μL，37 ℃水浴3 min，迅速加入已预热至37 ℃的PT试剂200 μL，混匀，立即计时，记录凝血絮状物出现的时间，即为PT。国际标准化比值(INR)的计算：INR=(PTexp/PTnor)ISI，其中ISI为国际敏感指数(ISI=1.24)，华法林单用0 h测定的PT为正常值(PTnor)，香叶木苷与华法林联用测定的PT为实验值(PTexp)。

2 结 果

2.1药动学结果 单剂量华法林+香叶木苷组的药动学参数Cmax，t1/2，AUC(0-t)，AUC(0-∞)和血药浓度均较单剂量华法林组有所升高，但2组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；华法林稳态+香叶木苷组联合用药后第1,2,3天华法林的血药浓度均较华法林稳态组有所升高，但2组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1和图2、图3。

表1 单剂量华法林组和单剂量华法林+香叶木苷组大鼠体内华法林药动学参数比较

图2 单剂量华法林组和单剂量华法林+香叶木苷组大鼠华法林血药浓度-时间曲线

图3 华法林稳态组和华法林稳态+香叶木苷组大鼠华法林血药浓度-时间曲线

2.2药效学结果 单剂量华法林+香叶木苷组PT明显长于单剂量华法林组(P<0.05)，INR明显高于单剂量华法林组(P<0.05)；华法林稳态+香叶木苷组PT明显长于华法林稳态组(P<0.05)，INR明显高于华法林稳态组(P<0.05)。见图4及图5。

图5 华法林稳态组和华法林稳态+香叶木苷组大鼠PT和INR比较

图4 单剂量华法林组和单剂量华法林+香叶木苷组大鼠PT和INR比较

3 讨 论

华法林是最常用的抗凝剂，包括S与R型两种光学异构体，在人类和大鼠体内，S-对映体比R-对映体更有效。华法林通过CYP450催化的代谢具有立体选择性，其中R型由CYP1A2和CYP3A4代谢，S型主要由CYP2C9代谢[3]，所以对CYP2C9活性的影响与抗凝作用的变化相关性更强。本研究药动学结果表明，与单用华法林相比，香叶木苷与华法林联用后华法林在大鼠体内的药动学参数均有所增加，但不明显。课题组在前期研究中发现，蓬子菜总黄酮对大鼠CYP1A2活性有诱导作用，对大鼠CYP2C11活性的影响存在剂量差异，中低剂量对CYP2C11无明显影响，高剂量抑制CYP2C11[15]，但其提取物香叶木苷对大鼠CYP2C11(与人体CYP2C9同源)具有一定的诱导作用，可能加快华法林的消除。另有文献报道华法林由肝脏转运入胆汁需由P-糖蛋白介导[19]，而香叶木苷可以抑制P-糖蛋白[20]，可能使华法林的转运、清除减少。因此推测蓬子菜中的香叶木苷对华法林在大鼠体内药动学的影响可能是对P-糖蛋白的抑制作用与对CYP2C11诱导作用的综合结果，导致其与华法林联用后华法林的血药浓度有所增加，但药动学参数变化并不显著。但有研究报道，香叶木苷在人体内对CYP2C9[16-17]和CYP3A4[18]活性产生抑制作用，这与本研究结果恰恰相反，因此推测香叶木苷对CYP2C9活性的影响可能存在种属间的差异性。

在药效学研究中发现，与单用华法林相比，华法林香叶木苷与华法林联用后PT延长，INR升高，说明香叶木苷能增强单剂量及稳态华法林的抗凝作用。既往研究证实，香叶木苷可抑制内源性和外源性凝血途径，在外源性凝血途径中，香叶木苷可使组织因子释放减少，进而减少其与凝血因子Ⅶ形成具有促酶活性的复合物，还能产生蛋白C系统，其与因子蛋白S一起灭活凝血因子Va与Ⅷa，共同产生抗凝血的作用[21]。华法林能抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的活化，从而达到抗凝作用[22]。依此进一步推测，香叶木苷与华法林联用后抗凝作用的增强可能主要通过抑制外源性凝血途径而实现，其综合作用机制见图6。

图6 香叶木苷影响华法林抗凝作用的机制

综上，香叶木苷与华法林联用时，虽然华法林的药动学参数变化不显著，但抗凝作用的增强使得INR明显增加，由于华法林的治疗窗较窄，INR超出正常范围易导致出血，故建议香叶木苷与华法林联用时，在监测血药浓度的同时，应增加INR监测次数并警惕可能的出血风险，必要时调整用药剂量避免出血的不良反应。另外，香叶木苷除在蓬子菜中具有较高的含量，还存在于其他多种植物及水果中，其对CYP2C9和CYP3A4活性影响可能存在种属之间的差异性，尤应加以关注并展开深入的研究，这一发现将为含香叶木苷的中药制剂、食物与华法林及其他药物的相互作用研究，及临床的安全合理用药提供重要科学依据。因此，广泛开展药物相互作用研究可使中西医结合治疗更客观、更科学，有效促进中西医结合治疗独特方法理论体系的发展。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。