清热祛湿外洗方制备工艺及薄层鉴别*

丁美林，张香玉，江建国

（1.东台市中医院，江苏 东台 224200；2.上海中医药大学，上海 200120；3.如东县中医院，江苏 如东 226400）

清热祛湿外洗方是江苏省如东县中医院协定方，由连翘、黄柏、苦参、板蓝根等中药组成，具有清热解毒、化湿透邪的功效，临床用于治疗儿童发热、手足口疱疹，伴有溃疡疼痛、纳差等症状，也就是儿童常见的手足口病。经多年临床应用并验证，清热祛湿外洗方对儿童患者使用方便、疗效良好。现代药理研究表明，金银花中有机酸有抗炎、抗病毒、抗菌等药理活性[1]；苦参中苦参酮、异黄腐醇、槐属二氢黄酮G 和苦参醇I 具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[2]；板蓝根木脂素类成分对流感病毒诱导炎症反应具有免疫调节作用[3]；黄柏主要含有生物碱类、酚酸类、三萜类和黄酮类等成分，具有抗炎、抗菌、降血压和免疫抑制等药理活性[4]。选用君药黄柏中盐酸小檗碱的含量、清热祛湿外洗方干膏率综合评分作为指标，正交试验确定清热祛湿外洗方的制备工艺，本研究根据《中国药典》（2020 年版）四部项下，薄层色谱鉴别法对连翘、苦参、黄柏、板蓝根进行薄层色谱鉴别，以期为医院制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司）；PHS-25B PH 计（上海大普仪器有限公司）；HPB-425i BEL 十万分之一电子天平（意大利贝尔Engineering srL）；HN101-1A 恒温电热干燥箱（上海苏进仪器设备厂）；WFH-203B 三用紫外分析仪（上海驰唐实业有限公司）；QCD3120 超声波清洗器（天津旗美科技有限公司）；HH-S2 数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）；DW-2 型调温电热器（南通市长江光学仪器有限公司）。

1.2 试药

苦参碱对照品（批号：110805-201709）；盐酸小檗碱（批号：110713-202015，中国食品药品检定研究院）；槐定碱对照品（批号：110784-201706，中国食品药品检定研究院）、连翘对照药材（批号：120908-201817，中国食品药品检定研究院）；板蓝根对照药材（批号：121177-201608，中国食品药品检定研究院）；硅胶G 板（批号：20220507；青岛海洋化工有限公司）、硅胶G 板（批号：20220508；青岛胜海精细硅胶化工有限公司）、硅胶G 板（批号：20140701；烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂）；清热祛湿外洗方（批号：20220218）；所用中药饮片均购自南通市三越饮片有限公司。

2 方法与结果

2.1 清热祛湿外洗方的制备工艺

2.1.1 浸泡时间与吸水率的考察

称取处方量药材，置于烧杯中，加入一定量的水，在室温下静置1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，每个时间段倒出被药材吸收剩下的药液体积，量取体积，称取重量，计算吸水率[5]，由浸泡清热祛湿方的时间与吸水率考察结果得出，清热祛湿外洗方浸泡3 h 左右即可，吸水率为197%。

2.1.2 正交试验

采用正交试验对水提取工艺进行考察，影响水提的主要因素为A 加水量（倍）、B 煎煮时间（h）、C 煎煮次数（次），将清热祛湿外洗方中盐酸小檗碱的含量、干膏率的综合评分作为考察指标，采用L9（34）正交试验设计优选最佳提取工艺参数[6]。因素与水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。分析表明，在清热祛湿外洗方水提过程中，加水量与煎煮次数为显著性影响因素（P＜0.05），可根据生产实际情况调整。正交试验优选的最佳工艺为A3B3C2，即加入12 倍量的水，煎煮3 次，每次1 小时。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析结果

2.2 清热祛湿外洗方的薄层色谱鉴别

2.2.1 连翘鉴别

取本品溶液20 ml，离心，去除上清液，取沉淀物，加乙醚5 ml 萃取3 次，合并滤液，水浴挥干，残渣加甲醇1 ml 使其溶解，作清热祛湿外洗方供试品溶液，同法制备（缺连翘）阴性对照溶液。取连翘对照药材6 g，加水回流提取，取连翘对照药材溶液20 ml，加乙醚萃取3 次，每次5 ml，过滤，合并滤液，挥干，残渣加甲醇1 ml 使溶解，作为连翘对照药材溶液。吸取10 μl 清热祛湿外洗方供试品溶液、连翘对照药材溶液、阴性对照溶液，按照2020 年版《中国药典》通则0502 试验，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶10∶0.25）为展开剂，展开后喷以10%硫酸乙醇溶液，置紫外灯光（365 nm）下检视斑点，阴性对照无干扰，结果见图1、图2。

图1 连翘薄层色谱鉴别图（预实验）

图2 连翘薄层色谱鉴别图

2.2.2 苦参鉴别

取清热祛湿外洗方10 ml，用氨试液调置pH 9～10，加三氯甲烷5 ml 萃取3 次，合并滤液，水浴挥干，残渣用1 ml 无水乙醇溶解，作清热祛湿外洗方供试品溶液，同法制备（缺苦参）阴性对照溶液。取苦参碱、槐定碱、苦参碱和槐定碱对照品，分别加一定量乙醇制备成对照品溶液。吸取2 μl 清热祛湿外洗方供试品溶液、苦参碱对照品溶液、槐定碱对照品溶液、混合对照品溶液、阴性对照溶液，按照2020 年版《中国药典》通则0502 试验，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8 ∶3 ∶1.5）为展开剂，展开，喷以碘化铋钾溶液，出现显著斑点，阴性对照无干扰，结果见图3、图4。

图3 苦参薄层色谱鉴别图（预实验）

图4 苦参薄层色谱鉴别图

2.2.3 黄柏鉴别

取清热祛湿外洗方10 ml，水浴蒸干，加甲醇10 ml，超声处理15 min，过滤，取滤液作供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 ml 含0.1 mg 的溶液，作对照品溶液，同法制备（缺黄柏）阴性对照溶液。取黄柏对照药材0.2 g，加甲醇10 ml，超声20 min，作黄柏对照药材溶液。吸取1～3 μl 清热祛湿外洗方供试品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液、阴性对照溶液，按照2020年版《中国药典》通则0502 试验，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开，置紫外灯光（365 nm）下检视，出现显著斑点，阴性对照无干扰，结果见图5、图6。

图5 黄柏薄层色谱鉴别图（预实验）

图6 黄柏薄层色谱鉴别图

2.2.4 板蓝根的薄层鉴别

取清热祛湿外洗方20 ml，超声30 min 后离心，保留上清液，水浴蒸干，加甲醇1 ml 使其溶解，作供试品溶液，同法制备（缺板蓝根）阴性对照溶液。取板蓝根对照药材2 g，加80%甲醇20 ml，超声30 min，静置一夜，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇1 ml 使其溶解，作板蓝根对照药材溶液。吸取10 μl 清热祛湿外洗方供试品溶液、板蓝根对照药材溶液、阴性对照溶液，按照2020年版《中国药典》通则0502 试验，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-石油醚（1∶1）为展开剂，展开，置紫外灯光（254 nm）下检视，出现显著斑点，阴性对照无干扰，结果见图7、图8。

图7 板蓝根薄层色谱鉴别图（预实验）

图8 板蓝根薄层色谱鉴别图

3 讨论

3.1 对清热祛湿外洗方的制备工艺讨论

清热祛湿外洗方治疗小儿手足口病，可加速疱疹消退，作为如东县中医院院内协定方已使用多年，儿科医师通过临床观测考察，清热祛湿外洗方临床疗效显著，且安全可靠，表明清热祛湿外洗方有其研究的价值。处方中连翘、苦参、黄柏、板蓝根等，具有清热解毒、化湿透邪的功效，可抑制炎症及调节免疫功能，是治疗小儿手足口病的重要机制[7]，且外洗方式便于儿童患者接受[8]，因此综合分析确定清热祛湿外洗方为水提工艺，外洗方式。根据中药君臣佐使处方分析，将君药黄柏中的盐酸小檗碱、处方药的干膏率做为考察指标，用正交试验确定制备工艺，为开发清热祛湿外洗方制备工艺打下良好的基础。

3.2 对清热祛湿外洗方的薄层色谱鉴别讨论

连翘薄层色谱鉴别过程中参照文献[9]，不能达到预期结果，而连翘在清热祛湿外洗方中属于君药之一，考虑连翘在处方分析中重要性，所以重新制定符合清热祛湿外洗方中连翘鉴别方案。总结分析在相同的条件下，对照药材溶液能出现显著的斑点而供试品溶液不能出现显著结果，所以需重新考察清热祛湿外洗方供试品溶液的制备。清热祛湿外洗方溶液为酸性溶液，连翘中含有醇苷，在酸性条件下不稳定，而选择加热水解能很好的分离出有效成分[10]，因此选择加热水解制备连翘对照药材溶液，其他条件不变的情况下，能达到对连翘的薄层色谱鉴别。

苦参薄层色谱鉴别过程中，曾参照《中国药典》[11]苦参项下鉴别，不能出现显著性斑点。根据苦参的化学性质[12]，总结分析实验需要调整展开剂的比例，因此将展开剂比例调整为甲苯-丙酮-甲醇（8 ∶3 ∶1.5），其他条件未变，能出现显著斑点但斑点有重叠现象。根据斑点重叠现象，分析提示可能是由于甲苯、丙酮等分析试剂为挥发性溶液，不利于斑点的分离，最终在其他条件不变的基础上将鉴别环境选择低温干燥下进行，斑点易分开，能够达到预期结果。

黄柏薄层色谱鉴别研究的文献较多，文献报道黄柏在不同的展开剂均能很好地出现显著性斑点，为了准确地找出清热祛湿外洗方中黄柏薄层色谱鉴别方案，因此将对照品溶液、对照药材溶液及供试品溶液制备方式、鉴别环境等相同条件下，展开剂选取正丁醇-冰醋酸-水[13]、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水[14]、二氯甲烷-甲醇-浓氨[15]分别进行考察，均能不同程度显现斑点，根据实际操作情况，最终确定方便易得的正丁醇-冰醋酸-水，定为清热祛湿外洗方黄柏薄层鉴别的展开剂。

板蓝根在中药君臣佐使分析中属于佐使药，顾全处方全局选取板蓝根进行薄层色谱鉴别，在初期方案中选取（R，S）-告依春、氨基酸、靛玉红等为对照品溶液，相同的环境下进行预实验考察，结果对照品溶液均不太理想[16]。因此，选用板蓝根对照药材作为对照溶液进行预实验，对照药材与供试品溶液预实验初期结果较为理想，薄层色谱鉴别过程中为了能够有效地达到预期结果，采用预实验与正式试验，验证试验的可重复性，因此根据预实验方案选定为板蓝根的最终实验方案。

3.3 总结

综上所述，将清热祛湿外洗方处方药浸泡3 h，加入12 倍量的水，煎煮3 次，每次1 h，结果表明清热祛湿外洗方提取工艺稳定可行。该制剂中连翘、苦参、黄柏、板蓝根的定性鉴别方法简便、重现性好，为清热祛湿外洗方的质量标准提供了参考。