食用菌发酵液对酸奶理化性质和营养成分的影响

马学兰 周连玉 巨家升 孙文娟 王龙瑞

(1.高原科学与可持续发展研究院，青海 西宁 810008；2.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810008；3.青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008)

黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens)，又名黄蘑菇、皇菇，夏秋季生长在低温、高海拔的蒿草草甸或草原上[1]。虎掌菌[Tremellodongelatinosum(Scop.)Pers.]，又名獐子菌、仲帽，因其外观独特，酷似虎掌因而得名[2]，多分布于中国西藏、青海等西部高山高寒地区的森林中[3]。野生黄绿蜜环菌和虎掌菌子实体中含有较丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、糖类等营养成分，具有丰富的营养价值和经济价值[4-5]。目前黄绿蜜环菌和虎掌菌人工栽培技术难度大[2-4]，因此多数研究者[6-8]采用液体发酵技术得到其菌丝体或胞内外代谢产物。

酸奶是一种富含益生菌的健康饮食，由牛奶经乳酸菌发酵制成，含蛋白质、维生素A和B、钙和锰等营养物质。研究[9]发现，添加食用菌发酵液可以提高酸奶中氨基酸等营养成分含量，赋予酸奶特殊的风味。目前，以黄绿蜜环菌或虎掌菌发酵液作为原料应用于乳制品的研究尚未见报道。

许多食用菌对硒具有很好的富集作用，在培养体系中能将无机硒转化为有机硒[10-11]。研究拟在牛奶中添加虎掌菌或黄绿蜜环菌富硒发酵液，接入单一菌或混合菌发酵后，探讨不同添加量的发酵液和不同乳酸菌对酸奶中感官指标、pH值、酸度、持水力、蛋白质、脂肪及矿质元素的影响，以期为未来营养强化型乳制品研制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

嗜热乳链球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、虎掌菌[Tremellodongelatinosum(Scop.)Pers.]菌种、黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens)菌种：青海师范大学实验室；

托伦宝纯牛奶：青海小西牛生物乳业股份有限公司；

葡萄糖：分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；

蔗糖：分析纯，天津市河东区红岩试剂厂；

氢氧化钠、磷酸：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；

亚硒酸钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

四苯硼钠：分析纯，上海迈坤化工有限公司；

钼酸铵：分析纯，天津市津北精细化工有限公司。

1.1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌锅：LS-35SD型，江阴滨江医疗设备有限公司；

台式低速离心机：TD5A型，湖南赫西仪器装备有限公司；

生化培养箱：250B型，金坛市富华仪器有限公司；

紫外分光光度计：V-5100型，金坛市富华仪器有限公司；

超净工作台：CJ-1S型，天津市泰斯特仪器有限公司；

水浴恒温振荡器：SHA-C型，金坛市天竞实验仪器厂；

微波消解仪：MD20H型，APL奥普乐仪器有限公司。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂粉20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL；

PDB培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL；

黄绿蜜环菌发酵培养基：KH2PO41 g、蔗糖40 g、MgSO41 g、牛肉膏1 g、Na2SeO30.14 g、蒸馏水1 000 mL[12]；

虎掌菌发酵培养基：葡萄糖60 g、酵母浸膏30 g、KH2PO41 g、Na2SeO30.10 g、蒸馏水1 000 mL[13]。

1.2 方法

1.2.1 黄绿蜜环菌和虎掌菌富硒发酵液制备

(1)虎掌菌富硒发酵液：根据文献[13]制备，其总硒质量浓度为(1.43±0.03)mg/L，可溶性蛋白质量浓度为(30.41±0.78)μg/mL，氨态氮质量浓度为(0.39±0.02)mg/mL，还原糖质量浓度为(5.27±0.09)mg/mL，pH(5.20±0.10)。

(2)黄绿蜜环菌富硒发酵液：根据文献[12]制备，其总硒质量浓度为(11.50±0.78)mg/L，可溶性蛋白质量浓度为(26.35±0.63)μg/mL，氨态氮质量浓度为(0.26±0.01)mg/mL，还原糖质量浓度为(48.39±0.76)mg/mL，pH(5.16±0.15)。

1.2.2 酸奶制作

(1)发酵剂制作：15 mL牛奶分装于100 mL广口瓶中，于115 ℃灭菌15 min，冷却后接入1 mL副干酪乳杆菌或接入嗜热乳链球菌和保加利亚乳杆菌各0.5 mL，40 ℃ 下培养至牛奶凝结[12]，得单一发酵剂或混合发酵剂，4 ℃冰箱中保存。

(2)富硒酸奶制作：在牛奶中加入6 g/100 mL的蔗糖，加热浓缩至一定体积后，于115 ℃中灭菌15 min，虎掌菌发酵液或黄绿蜜环菌发酵液3 000 r/min离心10 min，上清液经0.45 μm无菌滤膜除菌后，分别以0(对照)，5，10，15，20，25，30 mL/100 mL的添加量加入到预处理后的牛奶中，接入3 mL/100 mL单一发酵剂或混合发酵剂混匀，最终每瓶牛奶体积为20 mL，每个处理5瓶，置于42 ℃培养箱中培养8 h，将凝固后的酸奶置于冰箱冷藏24 h，用于理化性质和营养成分测定。

1.2.3 酸奶理化指标测定

(1)感官指标：参照谢海军等[14]的方法和GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》标准进行综合评价。

(2)pH值：用酸度计测定。

(3)酸度：按GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》中的酚酞指示剂法执行。

(4)持水力：离心称重法[15]。

1.2.4 酸奶营养成分测定

(1)可溶性蛋白：考马斯亮兰G-250染料法[16]。

(2)脂肪：按GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中的碱水解法执行。

(3)微量元素：酸奶经微波消解仪消解(工作参数见表1)后，分别采用GB 5009.87—2016《食品安全国家标准 食品中磷的测定》中的钼蓝比色法测定磷的含量、四苯硼钠法[17]、偶氮氯膦III法[18]、邻菲罗啉比色法[19]测定其钾、钙、铁含量。

表1 微波消解仪工作参数

1.3 统计分析

试验数据结果均采用平均值±标准差表示，各项指标釆用SPSS 16.0统计分析软件进行单因素方差分析(LSD，P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 对酸奶感官评分的影响

由图1可知，随着黄绿蜜环菌或虎掌菌发酵液添加量的增加，酸奶的感官评分(口感、风味和组织状态)逐渐降低。2种食用菌发酵液添加量为5～10 mL/100 mL时，单一菌或混合菌酸奶感官品质与对照组无显著差异(P>0.05)；但添加量高于10 mL/100 mL时，酸奶感官品质(口感、风味和组织状态)显著低于对照组(P<0.05)，与其他菌发酵液的效果有差异，30 mL/100 mL蛹虫草菌丝发酵液[20]、25 mL/100 mL红汁乳菇菌丝体发酵液[21]、20 mL/100 mL白鸡腿蘑发酵液[22]添加到牛奶中研制出的酸奶感官品质较好，可能与试验所使用的食用菌种类、发酵原料及发酵条件不同有关。由此可知，不同食用菌发酵液在一定用量下能够改善酸奶口感、风味和组织状态，但超过一定量时会影响酸奶凝乳状态和感官品质，可能是发酵液中过量的多糖与酸奶中的其他成分相互作用产生颗粒，使其口感变差[23-24]。

大写字母不同表示接入混合菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示接入单一菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)

2.2 对酸奶pH值的影响

由图2可知，当黄绿蜜环菌或虎掌菌发酵液添加量增加时，黄绿蜜环菌混合菌酸奶pH值逐渐增大、单一菌酸奶pH值降低，虎掌菌混合菌酸奶和单一菌酸奶pH值均减小。当黄绿蜜环菌发酵液添加量为10～30 mL/100 mL时，与对照组相比，混合菌酸奶pH值显著增大，单一菌酸奶pH值显著减小(P<0.05)，且混合菌酸奶pH值比单一菌酸奶高10%以上。添加虎掌菌发酵液后制得的单一菌酸奶与混合菌酸奶pH值变化不大。虎掌菌发酵液添加量为5 mL/100 mL时，单一菌酸奶pH值相比于对照组无显著性差异(P>0.05)，5～20 mL/100 mL发酵液时混合菌酸奶pH值较对照组无显著差异(P>0.05)。

大写字母不同表示接入混合菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示接入单一菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)

2.3 对酸奶滴定酸度的影响

由图3可知，随发酵液添加量增加，黄绿蜜环菌发酵液的单一菌和混合菌酸奶酸度逐渐增加，而虎掌菌单一菌酸奶酸度先增加后降低、混合菌酸奶酸度逐渐增加。不同添加量的黄绿蜜环菌发酵液单一菌酸奶酸度显著高于对照组(P<0.05)，虎掌菌发酵液除5 mL/100 mL外其他添加量单一菌酸奶酸度显著高于对照组(P<0.05)，滴定酸度均超过110 °T；混合菌发酵剂发酵酸奶时，5～20 mL/100 mL 添加量对酸奶的影响较小，除30 mL/100 mL黄绿蜜环菌发酵液外，其余添加量的酸奶滴定酸度均在70～100 °T。有研究表明，40 mL/100 mL猴头菇发酵液能够提高混合菌酸奶酸度且降低pH值[25]，15 mL/100 mL金耳发酵液能够提高单一菌酸奶酸度[26]。试验中黄绿蜜环菌和虎掌菌发酵液用量超过10 mL/100 mL后，混合菌酸奶酸度上升处于缓慢或者平稳趋势，可能是食用菌发酵液中多糖能够在一定程度上抑制发酵剂的发酵产酸[23]。

大写字母不同表示接入混合菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示接入单一菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)

2.4 对酸奶持水力的影响

由图4可知，随着发酵液用量的增加，黄绿蜜环菌混合菌酸奶持水力逐渐下降，虎掌菌混合菌酸奶持水力先增加后降低。有研究[26-27]表明，金耳发酵液酸奶或灵芝—白灵菇酸奶的持水力高于对照组。试验中，混合菌酸奶的持水力在5 mL/100 mL发酵液时并未受到显著影响甚至还有所提高，可能是酪蛋白在酸奶的酸性环境下会形成网状的空间胶体结构，可以有效容纳水分、小分子物质及乳酸菌。5～20 mL/100 mL黄绿蜜环菌发酵液混合菌酸奶持水性超过单一菌酸奶10%～30%，且混合菌酸奶持水力的最低水平与单一菌酸奶处于相同水平。当虎掌菌发酵液为5 mL/100 mL时混合菌酸奶持水力达到峰值87%，而其单一菌酸奶持水力较对照组显著减弱(P<0.05)。但当两种菌体发酵液添加量超过10 mL/100 mL后，较对照组有明显减弱，可能是由于酸奶的持水力受酸奶内总固形物及蛋白质含量变化的影响[28]。而试验发现采用混合菌发酵制作酸奶时，5 mL/100 mL 的虎掌菌发酵液持水力最高，且较黄绿蜜环菌酸奶强。

大写字母不同表示接入混合菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示接入单一菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)

2.5 对酸奶中蛋白质含量的影响

由图5可知，当黄绿蜜环菌或虎掌菌发酵液添加量增加时，黄绿蜜环菌单一菌酸奶蛋白质含量先降低后增加，虎掌菌混合菌酸奶蛋白质含量先降低后增加。除了15，25～30 mL/100 mL两个添加水平外，黄绿蜜环菌发酵液制成的单一菌酸奶蛋白质含量均显著低于对照组，虎掌菌发酵液单一菌酸奶与混合菌酸奶蛋白质含量均低于对照组(P<0.05)。Abd-Rabou等[29]用骆驼奶和藜麦制作混合发酵乳，发现添加藜麦种子制作的发酵乳中的蛋白质含量显著提高；Xiong等[30]研究发现蝉拟青霉发酵液制得的酸奶蛋白质含量显著高于天然酸奶蛋白质含量，与试验结果不一致，可能与研究使用的真菌发酵液中的成分、添加量及乳酸菌活性有关，尤其是酸奶中环境条件如pH影响着真菌产生的蛋白酶稳定性以及活性。添加5～20 mL/100 mL黄绿蜜环菌发酵液时，混合菌酸奶蛋白质含量比单一菌酸奶蛋白质含量高20%～230%。

2.6 对酸奶中脂肪含量的影响

由图6可知，除10 mL/100 mL虎掌菌发酵液脂肪含量相比于对照组不显著外，其余添加量黄绿蜜环菌和虎掌菌发酵液单一菌酸奶和混合菌酸奶脂肪含量均显著低于对照组(P<0.05)，可能是发酵液中存在脂肪酶，而其稳定性与活性又受到环境条件的影响。添加黄绿蜜环菌发酵液后，单一菌酸奶中脂肪含量高于混合菌酸奶脂肪含量20%～70%，且10～25 mL/100 mL虎掌菌发酵液单一菌酸奶脂肪含量高于混合菌酸奶。结合图5可知，混合菌酸奶蛋白质含量高于单一菌酸奶，单一菌酸奶脂肪含量比混合菌酸奶高，可能与发酵剂菌种的生理特性有关。

大写字母不同表示接入混合菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示接入单一菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)

大写字母不同表示接入混合菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示接入单一菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)

2.7 对酸奶中磷含量的影响

由图7可知，当发酵液添加量增加时，黄绿蜜环菌单一菌和混合菌酸奶磷含量呈先降低后增加趋势；虎掌菌单一菌酸奶磷含量逐渐减少，混合菌酸奶磷含量先增加后减少。添加黄绿蜜环菌发酵液后单一菌酸奶磷含量显著低于对照组(P<0.05)，添加量为15～30 mL/100 mL时混合菌酸奶磷含量显著高于对照组(P<0.05)。当黄绿蜜环菌发酵液添加量为15～20 mL/100 mL时，混合菌酸奶磷含量比单一菌酸奶磷含量高50%。与对照组相比，除10 mL/100 mL虎掌菌发酵液磷含量不显著外，其余单一菌酸奶磷含量显著降低(P<0.05)，15～30 mL/100 mL虎掌菌发酵液混合菌酸奶磷含量显著降低(P<0.05)。

大写字母不同表示接入混合菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示接入单一菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)

2.8 对酸奶中钾含量的影响

由图8可知，黄绿蜜环菌混合菌酸奶和单一菌酸奶钾含量随发酵液用量增加呈先升后降趋势。黄绿蜜环菌发酵液除5，30 mL/100 mL两个添加量外，其余添加量发酵液单一菌酸奶钾含量较混合菌酸奶高。黄绿蜜环菌发酵液为5 mL/100 mL时，混合菌酸奶钾含量显著高于对照组(P<0.05)。添加虎掌菌发酵液后，单一菌酸奶和混合菌酸奶钾含量均显著高于对照组(P<0.05)。

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2.9 对酸奶中钙含量的影响

由图9可知，随着发酵液添加量的增加，黄绿蜜环菌单一菌酸奶钙含量先降低后升高；虎掌菌单一菌酸奶钙含量先增加后减少，混合菌酸奶中钙含量呈倒“U”形。除了25 mL/100 mL黄绿蜜环菌发酵液制得的单一菌酸奶钙含量显著高于对照组外，其余用量的黄绿蜜环菌发酵液单一菌和混合菌酸奶钙含量显著低于对照组(P<0.05)，且添加量为25 mL/100 mL时，单一菌酸奶钙含量比混合菌酸奶高127%。与对照组相比，添加10～15 mL/100 mL 虎掌菌发酵液时，单一菌酸奶和混合菌酸奶钙含量显著上升(P<0.05)，与香菇菌液发酵酸奶中钙含量高于原味酸奶的结果[31]相似，且虎掌菌发酵液添加量为15 mL/100 mL时，单一菌酸奶钙含量比混合菌酸奶高30%。一般纯牛奶中钙含量丰富，经发酵后，钙等矿物质不会发生变化，然而试验中发现黄绿蜜环菌和虎掌菌发酵液用量对酸奶中钙含量的影响有差别，可能与发酵液中不同的生物质作用于乳酸菌菌体活性有关，其钙含量变化的规律性有待探讨。

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2.10 对酸奶中铁含量的影响

由图10可知，当黄绿蜜环菌发酵液用量增加时，混合菌酸奶铁含量先降低后增加，而单一菌酸奶铁含量先增加后降低。添加5 mL/100 mL黄绿蜜环菌发酵液时单一菌酸奶铁含量显著高于对照组(P<0.05)，20 mL/100 mL发酵液单一菌酸奶与对照组无显著差异，其他添加量的发酵液单一菌和混合菌酸奶铁含量均显著低于对照组(P<0.05)。虎掌菌发酵液添加量为15 mL/100 mL 时，单一菌酸奶铁含量较对照组显著增加(P<0.05)；当添加20～30 mL/100 mL 虎掌菌发酵液时，混合菌酸奶铁含量显著高于对照组(P<0.05)，尤其是发酵液添加为25 mL/100 mL时，其铁含量达到最高。有研究[30-31]表明，一定量的蝉拟青霉或香菇菌液发酵液能够提高酸奶中铁含量。添加发酵液后酸奶部分矿质元素含量变化规律与张凤琴等[31]研究结果有所差异，可能是由制作酸奶的原料、加入的发酵剂菌株、发酵条件以及食用菌发酵液中矿质元素含量不同等多种因素交互作用的结果。

大写字母不同表示接入混合菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示接入单一菌的酸奶之间差异显著(P<0.05)

3 结论

添加不同量的黄绿蜜环菌和虎掌菌发酵液或使用不同发酵剂时，混合菌酸奶感官评分、持水力均高于单一菌酸奶；除30 mL/100 mL黄绿蜜环菌发酵液外，添加其他发酵液由混合菌制成的酸奶酸度均优于单一菌酸奶；与对照组相比，添加黄绿蜜环菌发酵液的混合菌酸奶蛋白质、磷含量增加，混合菌制成的虎掌菌发酵液酸奶中钙、钾、铁含量显著提高(P<0.05)。利用低添加量的两种食用菌发酵液可改善酸奶理化性质(感官指标、pH、酸度、持水力)及营养成分(蛋白质、脂肪、矿质元素)，今后将进一步确定酸奶中硒含量及硒化学形态；为了迎合现代消费观念或特殊人群的需求，新型酸奶应具有营养丰富和功能性俱佳的特性，而这些特性与代谢产物有着密切关系，亟待借助代谢组学的方法解析富硒酸奶的代谢产物种类和含量，以预测其感官、营养和功能等特性。