五味子对产蛋期藏鸡肠道微生物菌群的影响

杨晓志，顾文婕，吉俊玲，董 飚，袁旭红，卞富智

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)

近年，由于抗生素滥用导致机体耐药性增加，肠道菌群紊乱，严重影响鸡的生产性能。因此，寻找能调节肠道内微生物多样性的平衡、绿色环保的添加剂具有重要的生产意义。相关研究表明，中药作为饲料添加剂，可通过调节肠道内微生物多样性的平衡，为共生菌在维持禽体健康，提高消化吸收能力、抵抗致病微生物，从而间接改善机体状况[1-3]，并通过肠道菌群代谢产生直接对机体有影响的活性物质发挥生理作用[4-7]。此外，中药还具有无药物残留、无抗药性及绿色环保等特点[8]，因此，相关研究备受国内外关注。五味子是我国林业特产之一，为木兰科多年生落叶木质藤本植物五味子的干燥成熟果实[9]，五味子含有多种化学成分，据文献报道，主要含有木脂素、多糖、挥发油、有机酸等。其中，以木脂素类的化学成分含量最高，可达8%[10]，其中，木脂素类的主要活性化学成分是五味子乙素[11-13]。在蛋鸡生产中有研究表明，五味子能促进蛋鸡子宫平滑肌兴奋，并且保肝解毒、促进肝糖元分解及抗应激，可提高代谢效率[14]、机体免疫力及生长性能[15]，并且促进卵泡发育和排卵，从而提高蛋质量及产蛋率，降低料蛋比，延长产蛋期[16-17]。前期相关试验表明饲料中添加0.5%的五味子有利于产蛋期蛋鸡的健康。目前，有关五味子在家禽生产中的研究主要集中在添加量对生产性能的研究，对其作用畜禽肠道微生物机理的研究较少。因此，本试验通过五味子添加饲喂试验，分析中草药五味子对产蛋期藏鸡肠道微生物多样性和菌群不同层级物种丰度的影响，探讨其与家禽肠道微生物的作用机制，为五味子在家禽生产上的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 选取健康无病、产蛋情况正常的40周龄产蛋期藏母鸡为试验对象，试验动物由江苏农牧科技职业技术学院家禽生产实训中心提供。

1.1.2 五味子 五味子是木兰科植物五味子的干燥成熟果实，习称“北五味子”，购于北京同仁堂大药房。试验前将五味子烘干粉碎至40目备用。

1.1.3 饲料 饲料采用产蛋期鸡饲料，购于南通正大饲料有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验将60羽藏母鸡随机分为对照组(CGB)、试验组(WWZ)，每组3个重复，每个重复10羽，对照组饲喂全价产蛋日粮，试验组饲喂添加0.5%五味子的全价产蛋日粮。

1.2.2 饲养管理 试验于2020年12月在江苏农牧科技职业学院家禽生产实训中心开展，试验鸡均为单笼饲养，自由采食饮水，试验期28 d。

1.2.4 DNA提取、PCR扩增和测序 运用CTAB法提取样品DNA，通过琼脂糖凝胶电泳法检测基因组DNA浓度及纯度。将DNA溶液稀释至 1 ng/μL 作为测序模板。使用16S rRNA基因的高度可变区域V3～V4区域扩增引物进行PCR扩增，PCR产物纯化、定量和均一化操作后建立测序文库用于测序。测序基于 Illumina HiSeq 测序平台，测序后序列进行拼接、过滤、除嵌合体，得到 Tags 序列。

1.2.5 构建样品稀释曲线 以随机抽取的序列的物种数目为纵坐标，以抽样序列数为横坐标，构建样本稀释曲线[18]。

1.2.6 OTU分析 在97%相似度水平下使用Usearch软件[19]对Tag进行聚类、获得OTU，绘制出样品组间Venn图[20]，比较试验组与对照组样品间共有、特有的OTU数目。基于OTU分析结果和Silva(细菌)和UNITE(真菌)分类学数据库对样品进行分类学注释。

1.2.7 物种注释及分类学分析 将组内每个样本门、纲、目、科、属、种不同水平对应物种的绝对丰度加和，再计算每个物种的相对丰度。对丰度水平前十的物种进行组间比较分析。

1.2.8 多样性分析 α多样性分析：对样品的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指数统计分析，研究单个样品内部的物种多样性。β多样性分析：采用Bray-Curtis和Weighted Unifrac这2种加权算法通过非度量多维标定法(NMDS)分析来比较不同样品在物种多样性方面存在的差异大小[21]。

1.2.9 组间差异显著性检验 根据设定的Biomarker筛选标准(LDA score>4)采用Lefse分析筛选出符合条件的Biomarker，分析对照组与试验组间相对丰度具有显著差异的物种[22]。

2 结果与分析

2.1 样品测序数据统计

通过对20羽产蛋期藏鸡肠道内容物进行16S rDNA V3～V4区进行高通量进行测序，按照97%相似度对OTU进行分类，一共得到1 374 847对Read，对Read进行双端拼接、过滤后共产 1 307 862 条 Clean tag，其中，Effective Tag(有效 tag)为1 210 021个。所测序列平均长度为 419 bp，GC含量平均为53%，且Q30均在96%以上，超过Q30>85%的质量要求，说明样品测序数据质量可靠，可进行试验数据分析。

经济性因素是海上风电场建设的重要因素，在满足结构安全性、可施工性因素后，各风机基础方案中经济性最好的方案将确定为嵌岩区域的风机基础推荐方案。在考虑经济性因素时，应综合考虑各基础方案的建造成本和施工成本，缺一不可。

2.2 样品稀释曲线分析

由图1可知，当样品随机抽取的序列数超过 10 000 时，稀释曲线趋于平缓并最终达平台期，表明测序深度已足够，大多数微生物多样性信息已被测出，并且能够反映出试验组和对照组藏鸡肠道微生物多样性组成，可进行后继数据分析。

2.3 样品OTU分析

试验对20个样品按照97%相似度对OTU进行分类，共检测出552个OTU，归类于16门、24纲、33目、59科、149属、171种，去除异常值后，对照组样品平均OTU为443个，五味子组OTU为477个。对比对照组和五味子组中所有OTU种类，由图2可知，五味子组和对照组有550个共有OTU，对照组有2个特有OTU，五味子组无特有OTU。组内样品间OTU分析结果，由图3可知，对照组内样本间共有OTU数目为70个，五味子组内样本间共有OTU数目为269个。

2.4 物种注释及分类学分析

2.4.1 基于门水平物种分类学分析 从门分类学水平进行肠道微生物群结构分析，通过序列对比和注释，最高归属为16个门。由图4和表1可知，藏鸡肠道微生物的优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门，相对丰度总和在96%以上，其中，厚壁菌门均为2组的第一大优势菌门。相较于对照组，五味子组厚壁菌门的相对丰度有明显降低，对照组高出试验组19.78%。而拟杆菌门的相对丰度明显升高，试验组拟杆菌门的相对丰度高出对照组16.37%，但差异均不显著(P>0.05)。

表1 门水平差异肠道菌相对丰度变化趋势

2.4.2 基于属水平物种分类学分析 通过序列对比和注释，样品间微生物归属于149个属，2组样品的微生物群落结构及相对丰度具体分析结果见图5。由图5可知，试验组组中拟杆菌属含量最高，相对丰度为20.87%，是第一优势菌属，乳杆菌属则是第二大优势菌属，相对丰度为10.74%，其余依次是考拉杆菌属，相对丰度为6.96%，理研菌科RC9肠道菌属，相对丰度为6.08%。对照组中乳杆菌属是第一大优势菌，相对丰度为31.53%，罗姆布齐亚菌属为第二大优势菌属，相对丰度为19.86%。其余依次是拟杆菌属，相对丰度为11.02%，理研菌科RC9肠道菌属，相对丰度为3.33%。

由表2可知，属水平差异肠道菌变化趋势可看出五味子组与对照组相比，乳杆菌属、罗姆布齐亚菌属、巨单胞菌属相对丰度均有所下调，分别减少20.79%和16.86%，但差异不显著(P>0.05)。拟杆菌属、理研菌属、考拉菌属、梭杆菌属、普拉梭菌属、脱硫弧菌属、瘤胃球菌属相对丰度均有所上调，分别为9.85%、4.41%、2.76%、0.28%、2.93%、1.11%和0.72%，其中考拉菌属相对丰度五味子组与对照组相比差异显著(P<0.05)。

表2 属水平差异肠道菌相对丰度变化趋势

2.5 多样性分析

2.5.1 α多样性分析 Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，则表明样品的物种多样性越高[23-24]。由表3可知，五味子组Shannon指数高于对照组，Simpson指数低于对照组，说明五味子组藏鸡肠道微生物多样性高于对照组，但差异均不显著(P>0.05)。Chao1和Ace指数衡量物种丰度的大小。由表3可知，五味子组Chao1和Ace均高于对照组，提示五味子组的样品丰度要高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。

表3 样本的α多样性指数

2.5.2 β多样性分析 NMDS图(图6)中点分别表示样品，点与点之间的距离表示差异程度，当Styress小于0.2时，表明在坐标图上距离越远，差异程度越大。由图6可知，对照组各点较为分散，样品间微生物多样性和丰度差异较大。五倍子组样品更为聚集，说明微生物多样性较为相似。

2.6 组间差异显著性分析

由图7可知，五味子组科水平上氨基酸球菌科相对丰度显著高于对照组(P<0.05)，属水平上考拉杆菌属的相对丰度显著高于对照组(P<0.05)，种水平上未培养的考拉杆菌的相对丰度显著高于对照组(P<0.05)。对照组各水平上未出现微生物的丰度显著高于五味子组的菌属。

3 讨论

3.1 五味子对藏鸡肠道微生物OTU的影响

通过对照组和五味子组藏鸡肠道中OTU的数目分析可知，五味子对产蛋期藏鸡肠道微生物种属类别的影响几乎可忽略。而对不同试验组内不同样品共有OTU进行分析可知，饲料中添加五味子后组内样本间共有的OTU数目由70个增加至269个，说明对照组藏鸡体内肠道微生物OTU相似性较低，饲料中在添加五味子后藏鸡肠道中的微生物相同OTU大幅度增加而且有变得更为相似的趋势。

3.2 五味子对藏鸡肠道微生物丰度的影响

通过对藏鸡肠道主要微生物相对丰度的分析可知，藏鸡肠道微生物以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门为主，占总菌群95%，这与相关文献报道鸡肠道微生物的组成、分布的研究结果[2，25-26]较为一致。本试验中五味子组与对照组相比拟杆菌门相对丰度有明显的上调，这主要与拟杆菌门下的拟杆菌属和理研菌属的相对丰度上升有关。这可能与五味子富含多糖类物质，而多糖是拟杆菌的主要能量来源，它可将复杂的多糖转化为可用化合物的能力，这就让拟杆菌比必须依赖其他能源的细菌在鸡肠道中更具竞争力。拟杆菌能够通过预防可能定殖和感染肠道的潜在病原体感染来使宿主受益。同时，试验结果还显示，五味子还显著提高了藏鸡肠道微生物中毛螺菌科、普拉梭菌属的相对丰度。毛螺菌科是厚壁菌门下梭菌目中最重要的优势菌群之一，其科内的粪球菌属是产丁酸的核心菌属，可以将复杂多糖分解成挥发性脂肪酸(乙酸、丁酸等)。挥发性脂肪酸可以调节肠道pH值，缓解病原菌导致的肠道感染和炎症，对肠道的健康有着极其重要的作用[27]。普拉梭菌属也是丁酸的重要生产者之一，具有抗炎作用，维持细菌酶的活性，保护消化系统免受肠道病原体的侵害。

相关研究表明，五味子对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌[12]、表皮葡萄球菌、肠球菌等[28]、肠道致病菌及绿脓杆菌[29]、淋球菌[30]有较好的抑制作用。本试验中五味子组与对照组相比厚壁菌门相对丰度下调较多，这主要是由厚壁菌门下的的乳酸杆菌属和罗姆布齐亚菌属的相对丰度下调较多引起的，但厚壁菌门下考拉菌属与对照组相比相对丰度显著增加，说明五味子对厚壁菌门下菌属微生物的抑制不具有普遍性。同时相关研究报道五味子浸提液可明显促进双歧杆菌和嗜酸乳杆菌体外生长[31]，本次试验结果与之不一致，产生这一现象的具体机理还有待进一步试验分析。

3.3 五味子对藏鸡肠道微生物多样性的影响

由α多样性分析可知，五味子组Chao1和Ace指数高于对照组，说明五味子使藏鸡肠道物种丰度升高；五味子组的Shannon指数高于对照组、Simpson指数低于对照组，因此五味子藏鸡组肠道微生物多样性高于对照组。β多样性分析表明，对照组样品间微生物多样性差异较大。因为对照组肠道微生物未经过人为干预，五味子组样品点更为聚集，说明微生物多样性较为相似，表明五味子对藏鸡肠道微生物产生了影响，而且作用效果相对一致。

3.4 五味子对藏鸡肠道微生物组间差异的影响

通过组间差异显著性分析，可以看出试验组的氨基酸球菌科、考拉杆菌属的相对丰度显著高于五味子组。氨基酸球菌科可产生乙酸和丁酸，可缓解肠道验证。考拉杆菌属可以消耗琥珀酸盐，使肠道中可利用的琥珀酸盐减少，艰难梭菌是伪膜性肠炎和抗生素相关性腹泻的病原菌，而艰难梭菌的生长十分需要琥珀酸盐，因此考拉杆菌属的增多可以抑制艰难梭菌的生长，从而减少此类疾病的发生。综上可以看出五味子一定程度上提高肠道中有益菌的相对丰度，改善肠道的健康。

4 结论

与对照组相比，藏鸡肠道微生物种类没有减少，饲料中在添加五味子能增加藏鸡个体间肠道微生物共有OUT数量，肠道微生物OTU变得更为相似。

在饲料中添加五味子后藏鸡肠道微生物中的拟杆菌门丰度增加，厚壁菌门丰度降低。与没有添加五味子相比，氨基酸球菌科、考拉杆菌属的相对丰度差异显著。

饲喂含五味子饲料后藏鸡肠道微生物的多样性升高，个体差异减小。

综上所述，饲料中添加0.5%五味子可以改变藏鸡肠道微生物结构，有利于对藏鸡肠道健康。