湿寒证对绝经后骨质疏松症模型大鼠下丘脑弓状核β-EP的影响

陈媛鑫， 阿衣努尔·买提斯迪克， 刘阗生， 买买提明·努尔买买提, 刘 凯

(1新疆医科大学维吾尔医学院， 乌鲁木齐 830017； 2新疆医科大学第一附属医院骨科显微修复外科， 乌鲁木齐 830054)

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是绝经后妇女由于雌激素缺乏发生骨代谢失衡、骨量低为主要特征的全身代谢性疾病[1]。骨代谢机制极复杂，在防治PMOP方面存在诸多争议，需进一步研究阐明其发病机制。下丘脑作为神经内分泌调节的中枢，参与调控PMOP[2]。弓状核为下丘脑神经分泌系统中重要的核团，通过多途径调控骨代谢[3]，弓状核β-EP则是调控骨代谢的重要途径[4]。课题组前期研究发现湿寒证可造成大鼠骨密度降低，骨折应力及杨氏模量下降，骨代谢尿指标钙、磷、I型胶原交联N-末端肽、I型胶原交联C-末端肽等处于紊乱状态[5]。进一步研究发现，湿寒证模型组大鼠血清中肾上腺皮质激素、皮质酮较正常对照组升高，下丘脑、垂体、肾上腺细胞器有不同程度的改变，提示湿寒证模型组的下丘脑-垂体-肾上腺轴可能处于应激中[6]。本研究在前期研究的基础上进一步研究湿寒证对下丘脑弓状核β-EP表达的影响，探讨湿寒证与弓状核功能之间的关系，从弓状核功能角度阐明湿寒证对骨质疏松症(Osteoporosis，OP)发生发展的部分机制。

1 材料与方法

1.1 动物4月龄未交配的SPF级雌性SD大鼠，体重(240±10)g，购自新疆医科大学实验中心。生产许可证：SCXK(新)-2018-0002。伦审会批号：LACUC20190916-01。

1.2 主要试剂与仪器β- EP一抗购自美国Novus Biologicals公司；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒等购自武汉博士德生物工程有限公司；抗体稀释液购自中杉金桥公司；EDTA修复液购自北京索莱宝科技有限公司；徕卡摊片机、徕卡组织包埋机、徕卡石蜡切片机(德国徕卡微系统有限公司)；RQH-350型人工气候箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.3 寒凉性饲料制备将普通饲料、芫荽籽+菠菜籽按7∶3比例混合制备[5]，委托于江苏省协同医药生物工程有限责任公司加工。

1.4 分组及造模

1.4.1 分组 将30只雌性SD大鼠按照随机数字表法随机分为5组，每组6只。依次设为正常对照组、假手术组、湿寒证模型组、OVX模型组、OVX+湿寒证模型组。正常对照组常规饲养，假手术组仅做假手术，湿寒证模型组加湿寒证病因因素，OVX模型组做OVX手术，OVX+湿寒证模型组做OVX手术加湿寒证病因因素。各组大鼠均自由摄食饮水。

1.4.2 造模 湿寒证模型的建立:参照文献[6]将湿寒证模型组大鼠置于湿寒环境,设置环境温度(6±1)℃，相对湿度85%～95%、寒凉性饲料喂养、冷水强迫游泳,水温: (6±1)℃，1 d/次、持续 5 min联合刺激24 d。骨质疏松症模型的建立：对OVX模型组大鼠采用摘除双侧卵巢法，第9周建立OVX模型。假手术组大鼠仅切除卵巢周围的脂肪组织。OVX+湿寒证模型的建立：参照文献[5]对OVX+湿寒证模型组大鼠用湿寒证造模方法与骨质疏松症造模方法联合同时干预，第9周建立模型。

1.5 检测指标

1.5.1 外观表征的观察 每周记录各组大鼠的证候表征变化，包括鼻唇、舌、行为状态、情绪反应、兴奋程度、体重、饮食等。

1.5.2 大鼠骨密度和微结构参数 胫骨甲醛固定24 h后，乙醇脱水，甲醛处理，包埋；用Micro-CT测量骨密度和骨形态计量学参数。

1.5.3 病理切片 用HE法染色观察下丘脑弓状核病理变化，包埋，切片，染色。

1.5.4 弓状核β-EP免疫反应阳性细胞数 使用SABC免疫组化法，参照试剂盒说明书进行操作，图片采用FIJI8.0图形分析软件分析，取其平均值进行统计分析。

2 结果

2.1 实验动物外在表征与正常对照组比，湿寒证模型组大鼠体型臃肿，鼻部潮湿，舌体胖大，舌苔白腻，蜷卧少动，尿色清、尿量明显增多，大便塘稀，体重增长缓慢，摄食量增加，饮水量减少，但总体呈上升趋势，呈现湿寒证候表征。见图1～3。

图1 正常对照组和湿寒证模型组大鼠摄水量比较

图2 正常对照组和湿寒证模型组大鼠摄食量比较

图3 正常对照组和湿寒证模型组大鼠体重增长比较

2.2 大鼠胫骨骨密度和微结构变化与正常对照组相比OVX模型组骨密度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，其中骨体积百分比下降、骨小梁分离度上升，结构模型指数升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明骨微结构受到破坏，有差异性改变，OVX造模成功。与OVX模型组相比，OVX+湿寒证模型组骨密度下降(P>0.05)，但骨小梁分离度上升、骨小梁分离度标准差、结构模型指数上升，差异有统计学意义(P<0.05)，表明骨微结构有改变。见表1。

2.3 大鼠下丘脑HE染色病理结果正常对照组大鼠下丘脑在低倍镜下可见弓状核区域神经元形态结构完好，神经元细胞数量均匀，组织结构致密，细胞间空隙较小，细胞核形态排列规则，细胞界限清晰(图4A)。湿寒证模型组细胞核形态排列不规则(图4B)，下丘脑基质疏松，开始出现部分细胞界限不清晰，核颜色加深(图4C)。OVX模型组弓状核区域出现明显的神经元坏死，胞质嗜酸性增强，细胞核固缩、溶解、消失，组织结构变疏松，细胞间空隙变大，呈现空隙状(图4D)。OVX+湿寒证模型组神经元细胞大面积凋亡，细胞界限不清，组织结构疏松，细胞间出现大面积空隙(图4E)。

2.4 大鼠下丘脑弓状核β-EP免疫反应阳性细胞数变化β-EP着色于胞浆呈黄色或棕黄色的颗粒。生理状态下下丘脑β-EP免疫反应阳性细胞呈高表达(图6A)，与正常对照组比，湿寒证模型组β-EP免疫反应阳性细胞数量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与正常对照组对比，OVX模型组β-EP免疫反应阳性细胞数量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与OVX模型组对比，OVX+湿寒证模型组β-EP免疫反应阳性细胞数量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5、6。

表1 各组大鼠胫骨骨密度和微结构参数

注：A,正常对照组;B,假手术组;C,湿寒证模型组;D,OVX模型组;E,OVX+湿寒证模型组。

注：与正常对照组(A)比较, △P<0.05; 与假手术组(B)比较, ▲P<0.05; 与湿寒证模型组(C)比较, #P<0.05; 与OVX模型组(D)比较, *P<0.05。

注：A,正常对照组;B,假手术组;C,湿寒证模型组;D,OVX模型组;E,OVX+湿寒证模型组(箭头示阳性细胞)。

3 讨论

中医病证结合模型是按中医基础理论复制，同时叠加现代医学疾病的模型[7]。本研究加入中医湿寒证致病因素，再联合OVX手术建立绝经后骨质疏松湿寒病证大鼠模型。本研究结果显示湿寒证模型组、OVX+湿寒证模型组加入湿寒证候病因，所构建的湿寒证大鼠模型，其外在表征与湿寒证临床症状基本相似。

中医理论认为脑具有调控骨的作用，“髓充骨养脑”和“脑-骨”轴为抗OP机制提供了新思路[8]。人体在低温环境下可激活中枢应激系统，改变应激因子和神经递质[9]。故湿寒证可引起下丘脑神经元细胞组织形态学改变，湿寒证可影响并加重其凋亡。β-EP是由弓状核前阿片黑皮质素裂解生成的神经肽，可被释放进入脑脊液影响大脑区域，作用于中枢神经系统[10]。β-EP对食物摄入量的长期调节是中度抑制，限制了食物的消耗[11]，故湿寒证模型组大鼠β-EP下降后，摄食量较正常对照组增加。β-EP产生的欣快感和幸福感使大鼠活跃，大鼠长期或反复受约束应激会减少β-EP作用在下丘脑μ-阿片受体的表达，出现整体应激反应，故湿寒证组β-EP降低后出现蜷卧少动的状态改变；β-EP受体的配体介导了骨系统中的生物效应，包括骨矿化、骨保护和免疫调节，通过能量代谢的相互作用参与骨骼形成。有研究表明，可通过抑制NF-κB信号通路，降低破骨细胞活性，从而预防或治疗OP[12]。β-EP可通过减少NF-κB信号通路下游的I-κBα和p65蛋白的磷酸化水平，从而调控NF-κB通路[13]。有研究表明，提高β-EP水平可调节骨代谢[14]。可见β-EP在OP的形成中发挥重要的调节作用。

本研究结果提示湿寒证是影响β-EP表达水平下降的原因，与正常对照比，湿寒证模型组β-EP表达下降，与OVX模型组比，OVX+湿寒证模型组β-EP表达较减少更为明显。环境因素对PMOP的形成密切相关，寒冷环境对骨密度影响较大，易造成骨量丢失，加速OP进程[15]。与OVX组比，OVX+湿寒证模型组骨密度下降更显著。本研究认为湿寒证可使下丘脑弓状核β-EP表达水平下降，而β-EP可调节骨代谢，故湿寒证可引起骨密度下降。本研究结果指出湿寒证可能是通过弓状核神经元形态结构改变及β-EP表达水平下降，导致绝经后大鼠骨密度减少、骨微结构改变,从而诱发OP的发生发展。β-EP可能是一个潜在的治疗靶点，通过调控β-EP表达水平从而预防OP。本研究阐明了湿寒证与β-EP的内在联系，为防治OP提供了新思路。但本研究样本量小，也没有相关信号通路的支持，今后的研究，应开展大样本并加入信号通路的检测，以期为中医药治疗OP提供更多理论依据。