小麦麸皮对枯草芽孢杆菌发酵花生饼粕的影响

于有伟，闫可婧，陶玮红，赵雪竹，崔雨博，张少颖，葛巍峰，任玉林

（1.山西师范大学 食品科学学院，山西 临汾 041004；2.青岛佳禾味真源食品有限公司，山东 青岛 266731；3.山西众一农业科技股份有限公司，山西临汾 041699）

花生饼粕是花生仁榨油后的副产物，形状通常为小块或粉状，淡褐色，有轻微的花生香味[1]。花生饼粕具有丰富的营养价值，它的蛋白质含有多种氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸含量较高。花生饼粕蛋白与动物蛋白相近，且不含有胆固醇，具有很高的消化性，可用于生产酱油等调味品的原料[2]。小麦麸皮是指小麦经过研磨和筛理工序加工成面粉的过程中，除去打碎入粉的胚乳后剩下的物料，占小麦籽粒质量的14%～15%，而且富含膳食纤维、低聚糖、蛋白质、植酸，同时还含有一系列的天然抗氧化剂[3]。枯草芽孢杆菌属于益生菌，菌体自身能够合成蛋白酶、纤维素酶等酶类[4]。试验选用枯草芽孢杆菌作为发酵剂，花生饼粕经适度发酵后，所含的蛋白质分解成氨基酸和小肽类等物质。为了提高蛋白质的降解效果，添加适量的小麦麸皮。研究可为食品加工业副产物花生饼粕和小麦麸皮开发成高值化的调味品等产品提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

花生饼粕，青岛佳禾味真源食品有限公司提供；小麦麸皮，山西众一农业科技股份有限公司提供；枯草芽孢杆菌（Bio-52746），北京百欧博伟生物技术有限公司提供；福林酚试剂，上海源叶生物科技有限公司提供；3,5 - 二硝基水杨酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、酒石酸钾钠、苯酚、羧甲基纤维素钠等，均为分析纯，天津市光复科技发展有限公司提供；其他试剂由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

752N 型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；SHZ-B 型水浴恒温振荡器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司产品；LS-50HD 型立式压力蒸汽灭菌锅，江苏滨江医疗设备有限公司产品。

1.3 样品处理

1.3.1 枯草芽孢杆菌发酵花生饼粕的过程

将花生饼粕粉碎→添加一定量的麸皮→采用121 ℃灭菌20 min→随后冷却接种→进行发酵。

1.3.2 菌种活化过程

首先配制营养肉汤种子培养基，50 mL 营养肉汤装于250 mL 三角瓶中，然后包扎封口，于121 ℃，0.1 MPa 条件下灭菌20 min。将在37 ℃下斜面培养24 h 的枯草芽孢杆菌接入冷却后的培养基。随后在水浴恒温振荡器上以转速200 r/min，温度30 ℃条件下培养20 h。

1.3.3 花生饼粕的固态发酵培养过程

取在5 个500 mL 的三角瓶，分别加入粉碎后的花生饼粕180 g，再分别加入0，10，20，30，40 g的小麦麸皮，料水比1∶1（g∶mL），121 ℃条件下，灭菌20 min，冷却至35 ℃左右进行接种发酵培养。

1.4 指标测定方法

1.4.1 枯草芽孢杆菌计数方法

采用细菌涂片计数法计算发酵过程中枯草芽孢杆菌的数量[5]。

1.4.2 中性蛋白酶活性测定

参照李洪康等人[6]的方法测定中性蛋白酶的活性。

上清液（粗酶液） 的制备：称取充分研磨的发酵物1.00 g，并用10 mL 的磷酸缓冲液（pH 值=7.5，适用于中性蛋白酶制剂） 充分溶解，过滤，即制得粗酶液待测。样品酶活力的计算公式如下：

式中：X3——酶活力，U/g；

A2——样品最终稀释液的活力，U/mL；

V1——溶解样品所使用的体积，mL；

4——反应试剂的总体积，mL；

n1——样品稀释倍数；

m4——样品质量，g；10 min 反应时间，以1 min 计，所得的结果用整数表示。

1.4.3 可溶性蛋白质检测

采用考马斯亮蓝G-250 法测定可溶性蛋白质的含量[7]。

1.4.4 纤维素酶活力测定

按文献所示，采用CMC 糖化力法测定纤维素酶活性[8]。准确称取发酵物1.00 g 置于研钵中，加入pH 值4.6 的醋酸缓冲液少量溶解，充分研磨后，将上清液转移至25 mL 的刻度试管。向研钵中的沉渣再次加入少量缓冲液研磨3～4 次，最后全部移至试管中并定容至25 mL，摇匀，滤纸过滤，即制得待测酶液。空白样的制备时，首先加入1.5 mL DNS 显色试剂，然后加入0.5 mL 适当稀释的酶液和CMC-Na溶液1.5 mL，按同样方法测定其吸光度Ack。

由以下公式进行计算：

式中：P——根据ΔA（ΔA=As-Ack） 从标准曲线中查得葡萄糖含量，mg/mL；

K——稀释倍数。

1.4.5 纤维素含量测定

利用蒽酮比色法进行测定纤维素含量，参考王伟等人[9]的方法进行测定。

1.4.6 氨基酸态氮含量测定

氨基态氮含量的测定采用甲醛值法[10]。

1.5 统计分析

试验中，各处理重复3 次；数据统计分析采用DPS 9.01 软件进行；采用Duncan's 新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中枯草芽孢杆菌数目变化

麸皮用量对枯草芽孢杆菌数目的影响见图1。

图1 麸皮用量对枯草芽孢杆菌数目的影响

由图1 可知，枯草芽孢杆菌随着发酵时间的延长，数目在不断增加。随着麸皮用量从0 g 增加到20 g，枯草芽孢杆菌数目也随着相应增加。从20～40 g 时，随着麸皮用量的增加，枯草芽孢杆菌的数量反而减少了。麸皮用量为20 g 时，枯草芽孢杆菌的数目最多，在72 h 时达到4.21×109个/ mL，约是未加麸皮的2 倍。说明添加一定量的麸皮有助于枯草芽孢杆菌发酵花生饼粕。添加适量麸皮可能会增加花生饼粕的透气性，同时麸皮可以为枯草芽孢杆菌提供丰富的碳源，因此对于好氧菌芽孢杆菌的生长有利。但是，当麸皮用量过多时，有可能添加过多的麸皮会使芽孢杆菌生长所需要的C/N 比等营养比例不合适，反而不利于其生长，枯草芽孢杆菌数目反而减少[11]。

2.2 麸皮用量对中性蛋白酶活力的影响

麸皮用量对中性蛋白酶活性的影响见图2。

图2 麸皮用量对中性蛋白酶活性的影响

由图2 可知，随着麸皮用量从0 g 增加到20 g，中性蛋白酶的活性一直在增大。当麸皮用量为20 g时，其蛋白酶活力最大31.09 U/mL。随着麸皮用量进一步增多，中性蛋白酶的活性开始下降。说明当麸皮用量为20 g 时，由于条件适宜，枯草芽孢杆菌生长较其他4 组好，有利于枯草芽孢杆菌产生中性蛋白酶。而当麸皮用量为0 g 时，蛋白酶活力为14.06 U/mL，这说明由于发酵培养基中仅添加花生饼粕，由于花生饼粕加水后呈小块状，透气性不佳，枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶少。当麸皮用量40 g时，蛋白酶活力仅为15.64 U/mL，过多的麸皮导致枯草芽孢杆菌生长所需要的营养相对减少，不利于枯草芽孢杆菌产生中性蛋白酶。

2.3 麸皮用量对可溶性蛋白质量浓度的影响

麸皮用量对花生饼粕发酵后可溶性蛋白质量浓度的影响见图3。

图3 麸皮用量对花生饼粕发酵后可溶性蛋白质量浓度的影响

由图3 可知，随着麸皮用量的增加，发酵后的花生饼粕中可溶性蛋白质量浓度先减少后增加。在麸皮用量为20 g 时，可溶性蛋白质量浓度最少为12.44 mg/mL，分别比麸皮用量为0 g 和40 g 的处理组低66.3%和68.3%。其原因可能是枯草芽孢杆菌可以产生中性蛋白酶，麸皮用量为20 g 时，枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶活性最大，由于蛋白酶可以将大分子蛋白质降解为肽、氨基酸等小分子物质。

2.4 麸皮用量对纤维素酶活力的影响

麸皮用量对花生饼粕发酵后纤维素酶活性的影响见图4。

图4 麸皮用量对花生饼粕发酵后纤维素酶活性的影响

由图4 可知，纤维素酶的活性随着麸皮用量呈现先增加后下降的趋势。在麸皮用量20 g 时，纤维素酶活性最大，为107.30 U/mL，约是不添加麸皮的8 倍。麸皮中含有较多的纤维素，适当增加麸皮用量纤维素酶活性的提高；但是当麸皮用量超过多时，可能营养条件不再适合枯草芽孢杆菌生长，因此所产生的纤维素酶活性降低。

2.5 麸皮用量对纤维素含量的影响

麸皮用量对发酵花生饼粕中纤维素含量的影响见图5。

图5 麸皮用量对发酵花生饼粕中纤维素含量的影响

由图5 可知，随着麸皮用量的增多，发酵的花生饼粕混合物中纤维素呈现增加的趋势。当麸皮用量为40 g 时，纤维素含量达到17.46%。原因可能主要有2 个方面，其一，由于麸皮本身含有丰富的纤维素。其二，过多的麸皮会使芽孢杆菌生长所需要的营养比例不合适，使其营养相对减少，不利于其生长。产生的纤维素酶活性也较低，分解的纤维素量也相应地减少[12]。

2.6 麸皮用量对氨基酸态氮含量的影响

麸皮用量对花生饼粕发酵后氨基酸态氮含量的影响见图6。

图6 麸皮用量对花生饼粕发酵后氨基酸态氮含量的影响

氨基态氮是酱油等调味品的重要指标之一，主要是通过蛋白质的降解而形成的。由图6 可知，与空白对照组中的氨基酸态氮含量为30.80 mg/100 g 相比，发酵后的花生饼粕中氨基酸态氮的含量都远远高于空白对照组。说明经过枯草芽孢杆菌发酵后，氨基酸态氮含量增加。当麸皮用量为20 g 时，发酵花生饼粕中的氨基酸态氮含量最高，为428.40 mg/100 g，约是未发酵花生饼粕的14 倍。原因可能是枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶可以将花生饼粕中的蛋白质大分子降解为肽、氨基酸等更小分子物质[13]；而且麸皮用量为20 g 时，枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶活性最高。因此，麸皮用量为20 g 时氨基酸态氮含量高于其他试验组。

3 结论

在枯草芽孢杆菌发酵花生饼粕的过程中，适量添加小麦麸皮有助于促进枯草芽孢菌的增殖，提高中性蛋白酶和纤维素酶的活性，有助于将花生饼粕中的蛋白质降解生成更多的氨基态氮。180 g 花生饼粕最适宜的小麦麸皮用量为20 g。研究可为食品加工业副产物花生饼粕和小麦麸皮开发成调味品等产品提供一定的参考。