五味子对对氯苯丙氨酸致失眠大鼠Toll样受体7信号通路相关基因m RNA表达的影响※

梁 可，乔 铁，李芳潇，郑冰元，朱明丹

（辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847）

失眠症又称为睡眠障碍（sleep deprivation，SD），是指睡眠的始发和维持发生障碍，致使睡眠质量不能满足个体生理需要而显著影响患者白天活动的一种睡眠障碍综合征[1]。随着社会的飞速发展，人们的生活节奏不断加快，工作生活压力日益增大，越来越多的人患上失眠症（如入睡困难、早醒、易醒等），长期失眠可造成大脑感觉和智力的敏感度下降，引起社会功能障碍，甚至诱发抑郁及其他精神类疾病[2]。目前，西医治疗失眠症以苯二氮䓬类药物为主，其能通过选择性地抑制脑干网状结构的上行激活系统，迅速诱导患者入睡，但因具有成瘾性、依赖性等不良反应，临床疗效尚有争议。

中医称失眠症为“不寐”“不得眠”“不得卧”“目不暝”，认为心主神明，心脾两虚、心血不足等均可导致失眠。五味子，味酸、甘，性温，归肺、心、肾经，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功，可用于治疗久嗽虚喘，梦遗，滑精，遗尿，尿频，久泻不止，自汗，盗汗，津伤口渴，内热消渴，心悸，失眠[3]。脾脏是机体重要的免疫器官，可与脑连接共同影响机体的免疫功能[4]。本研究探讨五味子对对氯苯丙氨酸（PCPA）致失眠大鼠脾脏Toll样受体7（TLR7）、干扰素调节因子7（IRF7）、干扰素α（IFN-α）mRNA表达的影响，探讨其改善睡眠的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠，体质量（250±20）g，雄性，由辽宁长生生物有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。

1.2 药物与试剂 五味子（安徽普仁中药饮片公司），PCPA（大连美仑生物技术有限公司，批号：MB3073），地西泮片（安定，山东信谊制药有限公司，批号：170601）；Trizol（美国Invitrogen公司），PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（Takara公司），SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ（TliRNaseH Plus公司），ROX plus（Takara公司），水合氯醛、氯仿、异丙醇、75%乙醇均购于国药集团。

1.3 药物制备 ①五味子提取物：取五味子适量，10倍量乙醇加热回流两次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩，干燥，加生理盐水溶解，制成0.15 g/m L五味子提取物溶液（其中五味子醇甲含量约为0.43 mg/g）[3，5]。②安定混悬液：将地西泮片研成细末，加水制成0.025 g/m L的安定混悬液。

1.4 主要仪器 荧光定量PCR仪（德国安捷伦公司），蛋白核酸分析仪（美国贝克曼公司），低温高速离心机（法国Jouan SA公司），Multiskan FC型酶标仪（Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 实验分组和给药 SPF级SD雄性大鼠32只，基础饲料适应性喂养7 d后，随机分成空白组、模型组、五味子组、安定组，每组8只。模型组、五味子组和安定组按0.3 g/kg体质量确定PCPA混悬液给予剂量，腹腔注射，每日1次，连续4 d。于第5日起，五味子组给予五味子提取物灌胃，安定组给予安定混悬液灌胃，连续14 d。空白组、模型组不予处理。各组大鼠于末次给药后24 h行水合氯醛麻醉（300 mg/kg），无菌条件下迅速摘取大鼠脾脏组织。

2.2 检测方法 每个脾组织样本取中段，约100 mg，加入1 m L Trizol，室温放置5 m in；4 ℃离心10 m in；取上清液，加入0.2 m L氯仿；震荡15 s，室温放置5 min；4 ℃离心15 m in，使溶液分为三相；取上层水相0.4 m L，加入0.5 m L异丙醇；混匀，室温放置10 m in，使RNA沉淀形成；4 ℃离心10 min；弃上清液，加入1 mL 75%乙醇，吹打、洗涤沉淀；4 ℃离心5 m in；弃上清液，空气干燥至乙醇全部挥发；溶解RNA，取稀释后的RNA样品，检测吸光度，计算RNA浓度。取0.5 μg RNA按10 μL反应体系进行反转录，按照PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明进行操作。使用Primer-BLAST工具设计引物[6]，内参基因为β-actin。TLR7上游引物：5'-GTGCCTTCAAGAAAGATGCCATT-3'，下游引物：5'-TGGTGGAGGAGAACAGAGCTT-3'；IRF7上游引物：5'-TGAACTTAGCCCGGAGCTTG-3'，下游引物：5'-AGGGACATACCCTGTGTGGG-3'；IFN-α上游引物：5'-GTGGTCAAAGCAGAAGTCTGGA-3'，下游引物：5'-TCTTTCTTCTCTCAGTCTTCCCAT-3'。应用荧光定量PCR仪检测，反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火1 m in后采集荧光信号，重复40个循环；在循环反应后，按设定条件（95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，95 ℃30 s）测溶解曲线。在55 ℃升温至95 ℃过程中，每升高0.5 ℃采集1次荧光信号。

2.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用方差齐性检验，方差分析用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 体征变化结果 造模后，模型组大鼠体质量下降，出现毛少无光、易受惊、烦躁易怒、昼夜节律消失等现象。灌胃后，五味子组与空白组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组大鼠体质量明显低于空白组（P＜0.01），安定组大鼠体质量低于空白组（P＜0.05）。五味子组与空白组大鼠的身体状态均相对较好，毛发有光泽，白天安静倦卧，无烦躁、易怒等症状。各组大鼠体质量见图1。

图1 各组大鼠体质量比较

3.2 五味子对PCPA致失眠大鼠TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表达水平的影响 模型组TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表达水平均明显高于空白组（P＜0.01）；五味子组TLR7、IRF7 mRNA表达水平均明显低于模型组（P＜0.01）；安定组TLR7、IRF7 mRNA表达水平均明显低于模型组（P＜0.01），IFN-α mRNA水平低于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠相关基因m RNA表达水平比较（±s）

表1 各组大鼠相关基因m RNA表达水平比较（±s）

注：1.TLR7，Toll样受体7；IRF7，干扰素调节因子7；IFN-α，干扰素α。2.与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

I F N-α m R N A表达水平组别 只数 T L R 7 m R N A表达水平I R F 7 m R N A表达水平空白组 8 1.0 0±0.0 5** 1.0 0±0.0 7** 1.0 0±0.0 4**模型组 8 2.7 0±0.1 1 4.1 5±0.1 8 1.3 3±0.0 8五味子组 8 1.2 5±0.0 8** 2.6 9±0.1 1** 1.2 7±0.0 8安定组 8 1.5 8±0.1 0** 2.7 0±0.1 5** 1.2 5±0.0 7*

4 讨论

免疫系统对睡眠有着重要的调节作用，同时睡眠也直接影响免疫功能，长期睡眠功能紊乱会严重影响免疫功能，导致感染、恶性肿瘤、抑郁症等疾病[8-9]。Toll样受体是一类信号传导跨膜受体，在先天免疫和获得免疫中有重要作用。TLR7主要分布在人体肺、脾脏等组织中，免疫细胞是主要表达TLR7的细胞，鼠类的TLR7与人高度同源[10]。TLR7经过一系列复杂活化过程，介导相关靶基因转录，使共刺激分子、促炎因子释放增加并激活IRF7因子，诱导IFN-α产生[11]。研究表明，TLR7高表达会使疾病发生率明显升高，而降低则可以缓解疾病[12-13]。IRF7能够在脾脏、淋巴结和骨髓中表达，可能是一种淋巴细胞特异性因子。激活后的IRF7在炎症和肿瘤中具有促进和抑制的双向作用，具体作用可能随微环境的不同而发生变化[14]。IFN-α能够使T淋巴细胞进行反向调节，延长活化后的T淋巴细胞生存期，使记忆性T淋巴细胞分化能力增加，还能诱导B淋巴细胞刺激因子，使B淋巴细胞受体与免疫球蛋白结合，最终产生致病的自身抗体[15]。

本研究结果显示，PCPA所致失眠大鼠体质量下降，出现毛少无光、易受惊、烦躁易怒、昼夜节律消失等现象，TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表达水平较高。经过五味子治疗后，大鼠体质量与空白组大鼠无明显统计学差异（P＞0.05），身体状态相对较好，毛发有光泽，白天安静倦卧，无烦躁、易怒等症状，同时TLR7、IRF7 mRNA表达水平有所降低。五味子可能通过活化TLR7信号通路激活免疫，通过下调TLR7信号通路的相关基因，从而影响免疫因子的释放，起到改善睡眠作用。本研究仅从基因水平考察五味子改善PCPA致失眠大鼠睡眠情况，后续研究还应从细胞、蛋白等多角度全面分析五味子通过影响免疫而改善睡眠的作用机制。