ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP对老年静脉血栓栓塞患者预后的预测价值

张元莉，路彩霞，董素敏，孙美兰

1 石家庄市人民医院心血管内科二病区，石家庄 050011；2 河北省沧州中西医结合医院急诊科；3 河北省沧州中西医结合医院介入血管外科；4 石家庄市人民医院建安病区

老年静脉血栓栓塞（VTE）是指老年患者血液成分在心脏和静脉血管腔内形成的血凝块，常由于机械、感染、免疫和血管自身病变造成血管内皮功能损伤，并通过止血机制促使血栓形成［1］。随疾病进展，血栓栓子发生脱落后导致组织缺血性改变，严重者发生肺栓塞［2-3］。因此早期诊断对老年VTE 治疗和预后有重要意义。循环核酸（cfDNA）是指在循环血液中游离于细胞外的DNA，其中包括游离的内源性循环DNA 和外源性循环DNA（ceDNA）。ceDNA 广泛存在于动物及人体血液中，已成为多种疾病诊断和预后判断的重要分子标记物，其参与炎症和血栓的形成与进展［4-5］。核小体是染色质的基本结构单位，通过内源性凝血途径促进血管内血液凝集，故推测核小体所诱导的凝血可能参与了VTE 的发生。中性粒细胞胞外诱捕网（NET）是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和单核细胞在外在刺激作用下释放的网状结构，可以捕获细菌、真菌等病原微生物，其水平升高可促进炎症反应，导致周围组织损伤［6］。VTE 的发生常与慢性感染、免疫有关，IL-18、hs-CRP作为临床常见的炎症指标，在VTE 发生时水平会发生相应改变。但目前以上指标在老年VTE 患者中的作用报道较少。故本研究探讨ceDNA、循环核小体、NET和炎症指标对老年VTE 患者预后的预测价值，旨在为临床诊断与治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018 年1 月—2021 年1 月石家庄市人民医院收治的老年VTE 患者100 例（VTE组）。纳入标准：符合中华医学会对VTE 的诊断与治疗指南［7］，临床表现为患肢疼痛、肿胀和软组织张力上升，实验室检查D-2 聚体＞500 μg/L，经多普勒超声检查确诊。排除标准：合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病；临床资料不完整。并同期选取行VTE 筛查的无VTE 老年人100 例（无VTE 组）。VTE 组男62 例、女38 例，年龄60～71（65.32 ± 2.37）岁，合并高血压65 例、糖尿病39 例。无VTE 组男65例、女35例，年龄61～70（65.49 ± 2.21）岁，合并高血压69例、糖尿病34例。两组性别、年龄、基础疾病比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

1.2 血液标本采集 于入组后采集两组空腹静脉血5 mL，置于真空抗凝试管，混匀后采用德国Hettich MIKRO220/220R 离心机离心，3 000 r/min离心10 min，离心半径为4 cm，分离血浆、血清。

1.3 ceDNA 检测 采用激光诱导荧光技术。将柠檬酸盐血浆在含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）和5 mm EDTA 的磷酸盐缓冲盐水稀释缓冲液中稀释20 倍；将50 μL 稀释的血浆与50 μL 含有荧光DNA嵌入染料的PBS 混合，在多板荧光计中记录荧光。以无DNA 染料的PBS 混合样品为背景，测定其自身荧光。

1.4 循环核小体检测 采用激光诱导荧光技术。用5 μg抗DNA 组蛋白H2A/H2B 复合抗体包被微量滴定板，将板用2% BSA 和1%干粉在37 ℃封闭1 h，并用PBS-Tween（PBS-T）洗涤1 次；将在PBS 中稀释10 倍的血浆样品加入孔中，并在37 ℃温育30 min，用PBS-T 洗涤孔3 次；加入含有1% Picogreen 的PBS，用多板荧光计记录荧光。

1.5 中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测 采用激光诱导荧光技术。用1 μg 抗DNA 组蛋白H2A/H2B复合抗体包被微量滴定板，将板用2% BSA 和1%干粉在37 ℃封闭1 h。将血浆在含有2 mmol/L EDTA和0.1% BSA 的PBS 稀释缓冲液中稀释20 倍，将稀释的血浆加入孔中并在37 ℃温育1 h；清洗培养皿，在37 ℃下与1 μg/mL兔抗人MPO 抗体在0.1% BSA的PBS 中温育15 min；洗涤后用0.1 μg/mL 辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗兔IgG 抗体在37 ℃下孵育15 min，检测抗MPO 抗体；洗涤后，使用ABTS溶液检测HRP 活性，从活化的嗜中性粒细胞中分离NET并用作阳性对照。

1.6 血清炎症指标检测 采用酶联免疫吸附试验检测IL-18，仪器选择小型VIPAS 全自动荧光酶标仪，试剂和试剂盒由武汉菲恩生物科技有限公司提供；采用乳胶增强免疫比浊法检测hs-CRP。选择VIDAS 型全自动荧光免疫分析仪，试剂和试剂盒由四川迈克生物科技股份有限公司提供，严格按仪器与试剂说明书进行操作。

1.7 预后随访 3个月后随访VTE组存活81例（存活组）、死亡19例（死亡组）。

1.8 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验。用受试者工作特征（ROC）曲线分析各指标对患者预后的预测价值，曲线下面积比较采用De-Long's test。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VTE 组与无VTE 组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP 比较 VTE 组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP 高 于 无VTE 组（P均＜0.05），见表1。

表1 VTE组与无VTE组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP比较（±s）

表1 VTE组与无VTE组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP比较（±s）

组别VTE组无VTE组P n 100 100 ceDNA（FU）100.35 ± 10.28 62.17 ± 6.19＜0.05循环核小体（FU）24.44 ± 2.51 17.71 ± 1.85＜0.05 NET（OD值）0.06 ± 0.02 0.04 ± 0.01＜0.05 IL-18（ng/mL）145.39 ± 14.53 122.27 ± 12.29＜0.05 hs-CRP（mg/L）8.25 ± 1.34 3.14 ± 0.35＜0.05

2.2 存活组与死亡组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP 比较 死亡组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP 水平高于存活组（P均＜0.05），见表2。

表2 存活组与死亡组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP比较（±s）

表2 存活组与死亡组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP比较（±s）

组别死亡组存活组P n 19 81 ceDNA（FU）139.17 ± 11.32 91.23 ± 9.52＜0.05循环核小体（FU）28.34 ± 2.85 23.52 ± 2.16＜0.05 NET（OD）0.08 ± 0.02 0.05 ± 0.01＜0.05 IL-18（ng/mL）185.37 ± 15.34 135.69 ± 13.34＜0.05 hs-CRP（mg/L）10.14 ± 1.29 7.83 ± 0.66＜0.05

2.3 ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP 对VTE 患者预后的预测价值 ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP 单独及联合检测预测VTE 患者预后的曲线下面积分别为0.731、0.674、0.707、0.658、0.665、0.847，联合检测预测价值更高（P均＜0.05），见表3。

表3 ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP对VTE患者预后的预测价值

3 讨论

研究发现，血栓形成与机体固有免疫系统关系密切，其中中性粒细胞可释放NET 促进血栓形成，ceDNA 表达水平可在一定程度上反映血栓内NET的形成［8］。因此ceDNA逐渐引起学者关注。

ceDNA 具有双螺旋结构，可单独游离于血液中，也可以复合体形式存在，其作用是进入人体细胞并传递遗传信息。研究显示，肺血栓患者线粒体DNA 水平、核DNA（nDNA）和ceDNA 水平显著高于健康人群，但恢复期ceDNA 水平与健康人群无明显差异［9］。核小体核心是由H2A、H2B、H3 和H4 各两分子组成的8 聚体，长度大约为146 bp 的DNA 负超螺旋所构成。当细胞死亡时，Caspases 蛋白酶被激活，核酸内切酶与核小体连接区结合并将染色质分解为多聚寡核苷酸与单核小体，参与循环的核小体就称为循环核小体。既往研究显示，当机体发生炎症反应时，免疫系统受到刺激，细胞死亡率升高，循环核小体清除减少［10］。NET是一种由颗粒衍生蛋白修饰的DNA 支架组成的胞外网状结构，包含多种活性物质，而细菌、病毒、真菌及癌细胞等因素可通过复杂的活化模式诱导中性粒细胞形成NET。已有研究显示，NET 相关蛋白已显示出诱导内皮毒性和增加血栓形成的能力，尤其是循环中NET cfDNA 组蛋白在炎性作用下被NET 释放，加剧炎性损害，造成恶性循环［11］。IL-18 是具有多种生物活性的炎症因子，参与免疫调节与炎症反应，其作用于血管内皮细胞，并促使细胞凋亡信号活化，导致细胞生长与功能异常，激活血管内皮细胞核因子-κB（NF-κB）进而诱导内皮因子死亡。NF-κB频繁激活可调节机体多种炎症因子水平，促进炎症进展，引起细胞损伤［12］，引发静脉血管内皮细胞的生理功能障碍，促进血栓进展。hs-CRP 是具有高敏感性的炎症指标，在机体受到损伤时显著升高，诱导单核细胞合成组织因子，激活外源性凝血途径，促使VTE形成。

本研究发现，VTE 组ceDNA、循环核小体、NET 、IL-18、hs-CRP高于无VTE组。推测原因可能是由于VTE 患者内皮细胞的生理功能发生障碍，使血液中ceDNA含量增加，诱导中性粒细胞形成NET，加剧了内皮细胞炎性损害，释放大量炎症因子（IL-18、hs-CRP等），且激活血管内皮细胞中相关信号通路，引起内皮细胞损伤，进一步促进血栓的发展。本研究随访3个月，存活组ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP水平高于死亡组。提示ceDNA、循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP对VTE患者的预后具有预测价值。且ROC分析可见，ceDNA预测VTE患者预后的曲线下面积高于循环核小体、NET、IL-18、hs-CRP。研究显示，ceDNA 是老年VTE 患者死亡的独立预测因子［13］，这与本研究中部分观点一致；且研究结果显示以上指标联合检测对VTE 患者预后有较高的预测价值。提示ceDNA 有望成为预测VTE 预后的分子标志物，但单一检测易造成误检与漏检，故可与其他指标联合检测以提高预测效能。

综上所述，临床可通过联合检测ceDNA、循环核小体、NET、IL-18 和hs-CRP 预测VTE 预后，并通过控制炎症及细胞内皮损伤改善患者预后。